Ферменты молока

 

 

Введение

Ферменты (от лат. fermentum— закваска) — это биологические катализаторы, которые ускоряют химические реакции в организме. Под их действием наиболее крупные молекулы белков, углеводов, жиров расщепляются на более мелкие. А продукты распада благодаря другим ферментам окисляются, высвобождая при этом энергию в них содержащуюся. В молоке, полученном при нормальных условиях от здорового животного, содержится около 100 ферментов различного происхождения, из которых исследователями выделено и идентифицировано более 20 истинных следующих классов — оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз и лигаз. Так одни (например, щелочная фосфатаза, лизоцим и др.) синтезируются непосредственно в секреторных клетках молочной железы животного, другие (например, каталаза, рибонуклеаза) поступают в молоко непосредственно из крови животного.

Большая часть истинных ферментов молока являются нормальными компонентами секреторных клеток, принимающих участие в клеточном метаболизме и синтезе составных частей молока и затем переходят в молоко. Кроме этих ферментов в молоке присутствуют многочисленные внеклеточные и внутриклеточные ферменты, продуцируемые микрофлорой молока и бактериальных заквасок. Некоторые ферментные препараты (сычужный фермент и его заменители, пепсин, галактозидаза и др.) специально вносят в молоко при изготовлении молочных продуктов.

Практически все ферменты которые можно встретить в молоке и молочных продуктах, имеют большое практическое значение. Таким образом на действии ферментов классов гидролаз, оксидоредуктаз и других основано производство кисломолочных продуктов и сыров. Протеолитические и другие ферменты, попадающие в молоко из воздуха и других источников напротив могут вызывать изменения составных частей молока, пороков вкуса и запаха во время выработки и хранения молочных продуктов, что может привести к снижению их пищевой ценности. Кроме того, по активности некоторых нативных (истинных) и бактериальных ферментов можно судить о санитарно-гигиеническом состоянии сырого молока или эффективности его пастеризации.

Ферменты ускоряют реакции много-много раз. Один фермент катализирует только одну специфичную для него химическую реакцию.  Фермент соответствует своему субстрату (веществу, химическое превращение которого он катализирует). На первой стадии ферментативной реакции фермент соединяется с субстратом и образуется так называемый фермент-субстратный комплекс, который затем преобразуется с разрывом химических связей субстрата, и продукты реакции отщепляются от фермента.

Ферменты действуют при определенной температуре и рН среде; их активность зависит от наличия химических веществ — активаторов и ингибиторов. Важнейшим фактором, от которого зависит действие фермента (скорость катализируемой им реакции) являемся температура. Оптимальная температура, т. е. температура, при которой ферменты наиболее активны, составляет 40—500С. Доказано, что некоторые ферменты обладают способностью восстанавливать свою активность после тепловой денатурации. Важным фактором, влияющим на активность ферментов, является рН среда.

Классификация 

В зависимости от химической структуры и специфического действия на различные субстраты ферменты подразделяются на классы (по Инихову):

-   гидролазы и фосфорилазы;

-   ферменты расшепления;

-   окислительно-восстановительные.

Первый класс - гидролазы и фосфорилазы

К ним относятся липаза, фосфатаза, протеиназа, редуктаза, лизоцим. Липаза – липолитический фермент. В молоке содержится нативная и бактериальная липаза, она катализирует гидролиз триглицеридов молочного жира, с выделением низкомолекулярных жирных кислот. Фермент связан с казеином и иммуноглобулином, и лишь небольшая часть адсорбируется оболочками жировых шариков. Липазы, выделяемые микрофлорой молока — психотрофными бактериями и плесневыми грибами, — обладают высокой активностью. При распределении липазы с белков на оболочки шариков жира, в случае создания определённых условий, наступает гидролиз жира, т.е. разложение жира на глицерин и жирные кислоты, что приводит к омылению и прогорканию молока и молочных продуктов.

Образующийся при гидролизе молочного жира глицерин, путём отщепления двух атомов водорода, может превратиться в глицериновый альдегид и разлагаться дальше. Разложение жирных кислот идёт путём окисления за счёт кислорода воды до образования уксусной кислоты, углекислого газа. Разложение молочного жира, вызываемого липазой в совокупности с другими факторами, сопровождается образованием промежуточных и конечных продуктов. Например, липоиды, в частности лецитин, подвергаются разложению, как ферментами микроорганизмов, так и др. катализаторами, в частности железом, что придаёт продуктам неприятный селёдочный привкус.

Молекулярная масса ферментов до конца не выяснена, по-видимому, они состоят из субъединиц, имеющих молекулярную массу от 7000 до 66000 (например, липопротеидлипазаявляется димером). Оптимальный рН для липазы составляет 6..10, для липопротеидлипазы — 8,7…9,0; оптимальная температура — 30…37"С. Активаторами липазы являются ионы кальция и натрия, липопротеидлипазы — белковые компоненты липопротеидов (апопротеиды) сыворотки крови, В качестве ингибиторов выступают соли тяжелых металлов, фосфо — липиды, компонент 3 бывшей фракции протеозо-псптонов.

Нативные липазы (особенно липопротеидлипаза) довольно термолабильны — инактивируются при температуре 74 и 80′С. Для сравнен ия — бактериальные липазы более термостабильны. Они разрушаются при 85…90°С. Нативная липаза теряет активность при температуре хранении молока от 0 до 5°С через 48 часов, но при повышении кислотности молока и молочного жира активность её возрастает.

Как правило, прогорклый вкус молока и молочных продуктов вызывает липаза, выделяемая посторонней микрофлорой молока – микрококками.

В то же время при производстве сыров камамбер, рокфор и др. участвует в формировании вкуса и запаха липаза, выделяемая специфической микрофлорой: молочнокислые палочки, лактококки и термофильный стерптококк.

Фосфатаза

В свежевыдоенном молоке обнаружена щелочная фосфатаза, секретируемая клетками молочной железы, но может и микроорганизмами.

Инактивируется фосфатаза при температуре 63°С с выдержкой 30 мин или 72-74°С без выдержки. Это положено в основу метода контроля эффективности пастеризации молока и сливок при невысоких температурах тепловой обработки (проба на фосфатазу).

В меньшем количестве содержится в молоке кислой фосфатазы, которая устойчива к температурам и инактивируется лишь при 97°С с выдержкой 6-4 сек.

Лактаза катализирует реакцию гидролитического расщепления лактозы на моносахариды: глюкозу и галактозу. Клетки молочной железы лактазу практически не синтезируют, её вырабатывают молочнокислые бактерии и дрожжи некоторых форм. Оптимальное действие лактазы при рН 5,0. Фермент применяют при выработке гидролизованной сыворотки, используемой в хлебобулочной и кондитерской промышленности. В медицине фермент применяют при нарушении пищеварения, связанного с непереносимостью к лактозе.

 С помощью лактазы можно превратить плохо растворимый молочный сахар в некристаллиэуемую и хорошо сбраживаемую смесь глюкозы и галактозы. Для этой цели фермент получают при культивировании определенных видов дрожжей, микроскопических грибов и грибов.

Фермент применяют при выработке гидролизованного молока, а также молочной сыворотки, используемой в пищевой промышленности (хлебобулочной, кондитерской). В настоящее время во всех странах находит широкое применение способ получения низколактозного питьевого молока, кефира, йогурта и других продуктов для детей и взрослых людей, организм которых недостаточно усваивает лактозу. В РФ для этой цели используют препарат «Максилакт» (производитель Нидерланды), представляющий собой дрожже вую лакта — ту, полученную из натуральных молочнокислых дрожжей К1иу\еготу — сез. Гидролиз лактозы; молока осуществляют при рН 6,3…6,7 и температуре 35..,40°С (ко препарат может работать при температуре 4…6"С).

Амилаза в молоке содержится в форме a-амилаза, связана с b-лактоглобулиновой фракцией молока. Количество амилазы в молоке повышается при заболевании животных. Инактивируется при температуре пастеризации.

Лизоцим - это очень важный фермент молока: он гидролизует связи в полисахаридах клеточных стенок бактерий и вызывает их гибель. Вместе с другими антибактериальными факторами (иммуноглобулинами, лактоферрином, лактопероксидазой, лейкоцитами и др.) лизоцим обусловливает бактерицидные свойства свежевыдоенного молока. Коровье молоко содержит небольшое количество лизоцима, в женском молоке его в 3000 раз больше. Он относится к основным белкам (имеет изоэлектрическую точку при рН 9,5), в кислой среде термостабилен.

Содержится лизоцим в молоке в небольших количествах (среднее значение 13мк/г в 100см3).

Протеиназы в молоке обнаружены нативные и бактериальные, которые отличаются строением каталитического центра. Все они вызывают гидролиз пептидных связей белков молока в основном a- и b- казеина, образуя пептоны, пептиды и аминокислоты.

Нативная протеиназа молока близка по строению к плазме крови и из неё попадает в молоко. Она вызывает гидролиз b- казеина с образованием g-казеина. Фермент инактивируется при 70°С 10 мин или 90°С – 5мин.

Бактериальная протеиназа вырабатывается микрофлорой молока микрококками, гнилостными бактериями, которые выделяют активные протеиназы, вызывающие различные пороки вкуса и запаха (гнилостный и др.).

Молочнокислые бактерии заквасок (лактококки и лактобациллы) выделяют активные протеиназы, которые имеют большое значение при производстве кисломолочных продуктов и сыров. Они формируют специфический вкус, консистенцию, рисунок сыров, повышая биологическую и пищевую ценность продуктов.

Протеазы животного происхождения и их заменители. При производстве творога и сыров для свертывания белков молока применяют кислые протеазы — химозин и пепсин. Обе протеазы содержат в активном центре карбоксильные группы аспарагиновой кислоты, обладают молокосвертывающей, протеолитической и пептидазной активностью.

Химозин, илиреннин содержится в сычуге телят, ягнят и козлят молочного возраста. Химозин образуется из предшественника — про — химозина. Его молекулярная масса составляет около 30 ООО, оптимум pH действия фермента равен 4 (фермент проявляет стабильность при pH 5,3…6,3). Химозин обладает высокой молокосвертывающей активностью и низкой протеолитической активностью.

Пепсин вырабатывается слизистой желудка взрослых животных (а также свиней и птиц) в виде пепсиногена, переходящего в активный 
фермент. Фермент получен в кристаллическом виде, его молекулярная масса раина 35 000, он имеет оптимум рН действия ферментов 1…2,2 и стабилен при рН 3,0…4,5.

Для свертывания казеина в сыроделии используют молокосвертывающий препарат, называемый сычужным ферментом (сычужным порошком), который содержит оба компонента сычугов крупного рогатого скота молочного возраста — химозин и пепсин.

Сычужный фермент имеет различное соотношение химозина и пепсина — чем ниже возраст теленка, тем выше содержание химозина в препарате. Отечественный сычужный порошок содержит 60…70% химозина и примесь 30…40% пепсина, имеет активность 100 000 усл. ед., оптимальную активность при рН 6,2 и температуре 404С. Из-за рубежа поступает сычужный порошок с содержанием химозина 75… 100% и активностью 150 000 усл. ед. и выше.

 

 

 

Второй класс – Ферменты расщепления

Рибонуклеаза по аминокислотному составу и свойствам аналогична рибонуклеазе поджелудочной железы. В молоко фермент попадает из крови животного. Рибонуклеаза молока катализирует расщепление рибонуклеиновой кислоты на нуклеотиды.

Третий класс – окислительно-восстановительные ферменты

Окисление в организмах рассматривается как процесс отнятия водорода, благодаря чему вещество окисляется. Отнятый водород передаётся другому веществу, в силу чего оно восстанавливается. Таким образом, при участии ферментов микроорганизмов происходит одновременно окисление одного вещества и восстановление другого. Этот процесс и ферменты получили название окислительно-восстановительные. К ним относятся дегидрогеназы, оксидазы, в т.ч. ксантиоксидаза, пероксидаза, каталаза и др. лактодегидразы.

Дегидрогеназы обнаружены в молоке в небольших количествах в виде нативных (истиных). Они являются катализаторами дегидрирования, при этом перенос атомов водорода осуществляют пиридиновые и прочие. Дегидрогеназы, вырабатываемые молочнокислыми бактериями и дрожжами заквасок, принимают активное участие в молочнокислом к спиртовом брожениях. Так, образование молочной кислоты из пировиноградной происходит с участием лактатдегидрогеназы, образование спирта из уксусного альдегида.

Дегидразы различают анаэробные и аэробные. Анаэробные передают отнятый водород любому веществу, кроме кислорода воздуха. Аэробные передают водород непосредственно кислороду воздуха.

Многочисленные дегидрогеназы накапливаются в сыром молоке при размножении в нём бактерий. Они называются редуктазами бактериального происхождения. Активность редуктаз и, как следствие, бактериальную обсеменённость молока определяют по продолжительности восстановления, т.е. обесцвечивания добавленного к молоку метиленового голубого или резазурина по редуктазной пробе. (ГОСТ 9225-84)

Редуктаза относится к анаэробным ферментам, она активна до температуры нагревания молока 60°С, инактивируется при температуре 75°С с выдержкой 5 мин. Все дегидрогеназы, вырабатываемые молочно-кислыми бактериями и дрожжами бактериальных заквасок, принимают активное участие в молочнокислом и спиртовом брожении.

 

 

 

К ним относится ксантиоксидаза из молочной железы и оксидазы, продуцируемые микрофлорой молока. Ксантиоксидаза катализирует окисление молекулярным кислородом пуриновых оснований до молочной кислоты, а также различных альдегидов до карбоновых кислот.

Ксантиоксидаза может передавать водород, отнятый у субстрата как кислороду воздуха, так и метиленовому голубому, т.е. происходит окисление. Этот фермент содержит железо и молибден, его содержание в молоке высокое. Считают, что в молоке и молочных продуктах ксантиноксидаза быстрее окисляет альдегиды, чем пурины. Образующийся при этом пироксид водорода обладает бактерицидным действием и (или) может актвировать антибактериальную лактонероксидазную систему.