Сибирская язва

Для того чтобы штамм B.anthracis был достаточно вирулентным, он должен продуцировать оба токсина (летальный  и отечный) и обладать способностью к образованию капсулы. Такие  штаммы имеют в своем составе  две плазмиды патогенности:

pXO1 - кодирует синтез токсинов;

pXO2 - отвечает за образование антифагоцитарной капсулы, позволяющей возбудителю избежать воздействия иммунной системы.

Выработка этих факторов патогенности зависит от ряда условий: концентрации в окружающей среде гидрокарбонатов, определенного температурного режима и др. Как указывалось, B.anthracis вырабатывает три термолабильных белка:

-протективный антиген;

-летальный фактор;

-отечный фактор.

Последние 2 белка попарно  соединяются с протективным антигеном  и образуют 2 экзотоксина, известных  как летальный и отечный токсины. Отечный токсин состоит из отечного фактора и протективного антигена. Летальный токсин, в свою очередь, также состоит из двух компонентов - летального фактора и протективного  антигена. Протективный антиген, выполняя роль молекулы-переносчика, является необходимым  компонентом при реализации токсических  эффектов, обусловленных обоими токсинами.[11]

Основная функция протективного  антигена - формирование в мембране клетки каналов. Через них внутрь проникают остальные компоненты токсина - отечный и летальный  факторы. На первом этапе протективный антиген связывается со специфическими рецепторами на поверхности мембраны клеток млекопитающих - главным образом  макрофагов. Они называются ATX-рецепторами (anthrax toxin receptor) и относятся к мембранным белкам I типа. После закрепления  на мембране клетки-мишени под действием  мембранной протеазы происходит олигомеризация протективного антигена с образованием гептамера, который последовательно  связывается с отечным или  летальным фактором. Образовавшийся комплекс проникает в цитоплазму клетки посредством рецепторопосредованного эндоцитоза [4].

В настоящее время с  помощью генно-инженерных методов  получен дефектный протективный антиген. Введение экспериментальным  животным такого антигена предотвращает  развитие болезни из-за нарушения  встраивания собственного протективного  антигена B.anthracis в мембрану клетки-мишени.

Летальный токсин - основной фактор патогенности B.anthracis - является одной из ведущих причин смерти инфицированных животных. Внутривенное введение его  крысам в эксперименте приводит к  гибели животных менее чем через 38 минут. Обладая выраженной протеолитической активностью, летальный токсин в  сочетании с отечным индуцирует лизис макрофагов, вызывает отек и  ингибирует рост клеток в культуре тканей. После связывания с рецепторами на поверхности макрофагов летальный токсин индуцирует поглощение клеткой кальция и нарушает внутриклеточный синтез макромолекул. Воздействуя на протеинфосфатазы, летальный токсин вызывает апоптоз и некроз клеток, что в конечном итоге приводит к быстрому, в течение 2 часов, лизису макрофагов.

Летальный фактор является цинкзависимой протеазой, имеет  сложную химическую структуру и  состоит из 4 доменов, каждый из которых  выполняет специфическую функцию. Отечный фактор представляет собой кальций- и кальмодулинзависимую аденилатциклазу, при участии которой синтезируется цАМФ в цитоплазме эукариотических клеток. Компоненты токсинов B.anthracis обладают способностью блокировать фагоцитоз опсонизированных бактерий. Наряду с подавлением фагоцитоза оба токсина в комбинации ингибируют кислородозависимые бактерицидные системы полиморфно-ядерных лейкоцитов (нейтрофилов).[4]

Эффекты летального токсина  реализуются через активацию  ряда цитокинов, в том числе интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли, выделяемых из поврежденных макрофагов и приводящих к нарушению свертывающей системы  крови, а также способствующих развитию септического шока и распространенного  отека тканей. Применение антагонистов рецепторов интерлейкина-1 позволяет частично блокировать эффекты летального токсина. Антагонистической активностью в отношении летального токсина обладают и некоторые другие препараты, такие, как каптоприл и хлорохин, а также синтетические белковые структуры, например Bcl-XL-протеин. Более того, в недавних экспериментах на мышах был обнаружен ген Ltxs1, кодирующий синтез особого белка (kinesin-like motor protein), ответственного за устойчивость макрофагов к летальному фактору B.anthracis.[12]

4.2. Морфология возбудителя

Прочно заняв со временем новое экологическое место, бацилла  стала самостоятельным паразитическим видом, сохранившим много сходных  черт со своими предками сапрофитами (Колонин, 1970). Bac. anthracis - сравнительно крупная палочка (от 1 - 1,3 до 3-10 мкм), неподвижная, образует капсулы и споры, по Грамму красится положительно. Вегетативные клетки могут быть с капсулой и без нее. Бациллы, выращенные на плотных или в жидких питательных средах, формируют цепочки разной длины. В мазках культур штаммов, дававших в жидких питательных средах типичный рост в виде хлопьевидного осадка, палочки чаще располагаются длинными цепочками, а в изготовленных из культур с атипичным диффузным ростом они образуют короткие цепочки. Клетки в цепочках неодинаковой величину и напоминают цилиндры. Поверхность клеток неровная. В окрашенных цепочках концы палочек, обращенных друг к другу, прямые, как бы обрублены, свободные же концы слегка закруглены. Бациллы, синтезирующие капсулу при росте на средах, содержащих белки, и размножении в организме животных, формируют цепочки в виде бамбуковой трости, обрубленные концы клеток несколько вдавлены и в местах сочленения симметрично утолщены.[7] Бациллы имеют ядро. Ф.Я. Китаев (1922) установил, что оно принимает участие в делении вегетативных клеток и его часто обнаруживают у прорастающих спор. Позже наличие ядра у бациллы подтвердил Flewett (1948). В 1959 г. М.П. Мейсель и Л.В. Миролюбова определили, что ядро состоит из спиралевидных нитей, занимающих центральную часть клетки и располагающихся вдоль ее оси. Нуклеоид представлен в основном сетью фибрилл, лежащих беспорядочно, по равномерно по всей его площади. Chatterjee и Williams (1962) указывают, что у клетки из молодых культур хроматиновые тела имеют вид длинных непрерывных образований, располагающихся центрально. В зрелых клетках они бывают как непрерывными, так; и делящимися на половины. В бациллах обнаружены ДНК и РНК, первая содержится в нуклеоиде, вторая - в цитоплазме.[12] Молекула ДНК-хромосомы двухцепочечная, замкнута в кольцо и своеобразно упакована в виде волокнистого тяжа, напоминающего перекрученный жгут соломы. Компактная форма ДНК поддерживается одноцепочечной рибонуклеиновой кислотой, в свою очередь связанной с РНК-полимеразой и катионными белками. Длина вытянутой молекулы ДНК-нуклеоида почти в 2 раза превышает длину самой бациллы. Стенка бациллы состоит из трех слоев: из двух осмиофильных и одного осмиофобного. Но такое строение выявляют не всегда. Чаще стенка состоит из внутреннего осмиофильного, более плотного, и наружного, умеренно плотного, слоев. Наружный слой нередко переходит в фибриллярные структуры, расположенные по всей поверхности клетки. Полагают, что эти осмиофильные фибриллярные образования - остатки капсулы.[10]

В клеточной стенке заметны канальцы, соединяющиеся с цитоплазматической мембраной и открывающиеся во внешнюю среду. Цитоплазматическая мембрана гладкая или несколько извилистая. Лишь в некоторых участках клетки заметны ее три слоя, лучше они видны в лизированных бациллах. Чаще мембрана плотно примыкает к клеточной стенке, и выявляют ее в виде одного слоя. Мембрана имеет выпячивания в цитоплазму, различающиеся по форме, величине, строению и локализации; они описаны как внутрцитоплазматнчсские мембранные структуры. Выпячивания имеют форму завитков, овалов и неровных линий, у многих бацилл они проникают в зону нуклеоида. В цитоплазме бацилл обнаруживают четко контурированные вакуоли. Обычно они крупные, ограничены мембраной, которая служит им каркасом. С наружной стороны ее лежат рибосомы. Расположены они цепочками, формируя полирибосомы. Последние лучше заметны в лизированных клетках. Нередко вакуоли сосредоточены вблизи нуклеоида. Gerhardi (1967) полагает, что вакуоли возникают в результате растворения в процессе фиксации и обезвоживания включений липидной природы и прежде всего гранул поли-оксимасляной кислоты.[8] В бациллах находятся липопротеиновые гранулы, расположенные главным образом субтерминалыю н терминально. Выявлены также мезосомы (эквиваленты митохондрий). Они имеют форму четко контурированных, ярко светящихся желто-зеленым цветом гранул, контактирующих с цитоплазматической мембраной. Мезосомы полифункциональные. Мембранно-мезосомная система бацилл ответственна за окислительное фосфорилирование, перенос электронов, осуществление цикла ди- и трикарбоновых кислот, она вовлекается и в синтез белка (Бурд, 1967; 1968).

Размножаются бациллы способом деления. В клетке формируется поперечная перегородка, которая разделяет  ее на две равно-половинные особи. Образование  перегородки начинается с инвагинации  цитоплазматической мембраны и вовлечения в этот процесс клеточной стенки. Постепенно клетка как бы перешнуровывается. Однако часто новое деление клеток начинается до завершения первого деления, что приводит к формированию стрептобацплл. Образующаяся цепочка состоит из клеток разной длины. Бациллы выделяют экзотоксин, играющий ведущую патогенетическую роль в развитии болезни. В процессе биосинтеза и секреции экзотоксина при выращивании бацилл на специальных средах отмечают интенсивное развитие рибосомального и мембрано-мезосомалыюго аппаратов, между ними устанавливается тесная связь, н внутрицитоплазматические мембранные структуры проникают в зону нуклеоида. В экспоненциальной фазе роста культура состоит в основном из неделящихся клеток (Дунаев, 1972). В зоне нуклеоида наблюдают большое скопление осмофильных масс. В некоторых участках клеток обнаруживают внутрицитоплазматические каналы, отличающиеся по морфологии от мембранных структур обычного типа у микробов этого вида. Они прямые, короткие. Каналы проходят через клеточную стенку и сообщаются с окружающей средой. Обнаруживают единичные клетки с лизированным протопластом, но хорошо сохранившимися мембранными структурами. У этих клеток часто находят участки разрушенной клеточной стенки. В данной фазе бациллы секретируют токсин. Из бациллярной клетки он может транспортироваться тремя путями: токсин выходит через специальные каналы, через неразрушенную, но измененную клеточную стенку и через участки лизированной клеточной стенки. В плазме бацилл имеются включения компактных осмиофильных частичек. За пределами микроба они располагаются в менее оптически плотном веществе, тоже выделяемом бациллами. По мере удаления от бацилл частички становятся крупнее и между ними увеличивается расстояние. Описанное строение бацилл характерно для вакцинных и вирулентных штаммов сибирской язвы. [6]

Образование капсул. Бациллы в организме животного и при культивировании на питательных средах с большим содержанием нативного белка образуют капсулу. В присутствии кислорода воздуха она не формируется. Капсула -- это наружный слизистый слой бациллы, ее рассматривают как слой эктоплазмы. На ультрасрезах она заметна в виде компактного толстого слоя, тесно примыкающего к стенке вегетативной клетки. Капсула имеет несколько слоев. Внутренняя часть ее образована кислыми мукополисахаридами, средняя -- белково-полисахаридным комплексами, наружная -- мукопептидами и полипептидами. В наружных слоях капсулы и в оболочке клетки мукопептиды отличаются по своим свойствам. Капсула, состоящая из 98% воды, обладает защитным осмотическим действием против притока большого количества воды в бациллу и предохраняет ее от обезвоживания, а также от различных воздействий среды, в том числе и от иммунных механизмов организма. Капсула препятствует фагоцитозу Вас. anthracis и способствует, по мнению Н.Н. Гинсбурга (1960), фиксации их к клеткам макроорганизма. Полагают, что она определяет степень вирулентности бацилл. Бескапсульные сибиреязвенные бациллы лишены этих свойств. Капсула образуется как в жидких, так и на плотных сывороточных питательных средах. При росте на среде Гладстона и Филдса капсула начинает выявляться у некоторых бацилл через 3 ч инкубации (Машков и Бодиско, 1968), а к 14--10 ч она имеется почти у всех. Затем возникает диффузия капсульного вещества с поверхности клеток в окружающую среду. Хорошо образуются капсулы и при росте бацилл в сыворотке крови лошади по Шеферу, на сывороточном агаре, особенно при избытке С0₂, а также при выращивании в белковых средах, применяемых для получения протективного антигена. В данном случае образование капсулы начинается через 2'/₂ ч роста и этот процесс бывает хорошо выражен у шестичасовой культуры; капсулы обнаруживают и у клеток через 24 ч роста. Элективным субстратом для биосинтеза капсул является белковая среда ГКИ. Капсулообразованию, кроме нативного белка, способствуют щелочная среда и наличие С0₂. Eastin, Thorne (1973) установили влияние С0₂ на активность некоторых митохондриальных энзимов бацилл. Вирулентные бациллы при образовании капсульного полипептида нуждаются в более высокой концентрации С0₂.[5]

Для синтеза важнейшего фактора вирулентности - капсулы - необходимы аминокислоты лейцин, валин и метионин. Для оптимального размножения вирулентных штаммов бацилл требуются гипоксантин, метионин, аланнн и триптофан. Степень вирулентности во многом определяется условиями выращивания бацилл и составом среды. В экспотенциалыюй фазе роста культуры вирулентных вакцинных штаммов наряду с капсульными выявляют и бескапсульные бациллы. Это свидетельствует о том, что в популяции штаммов появляются мутанты с иными генетическими свойствами, без капсульного полипептида глутамниовой кислоты. В организме животного бациллы с капсулами обнаруживают через 2--3 ч после заражения, но в этот период их находят только в местах введения и регионарных лимфатических узлах. Они окружены тканевым детритом и расположены в зонах (светлых), обрадованных действием токсина микроба. При попадании бацилл в иммунный организм капсулы, по-видимому, образуются очень медленно и довольно редко. Морфологически капсулы бацилл, размножающихся в организме и выращенных па питательных средах, но имеют различия, только у последних капсула более массивная. Капсула более устойчива к процессам гниения, чем сама бацилла, поэтому в гниющем трупе животного, павшего от сибирской язвы, обнаруживают лишь «тени микробов», пустые капсулы.[5, 12]

Образование спор. Биологическая роль спор заключается в том, что они являются формой сохранения вида бацилл при неблагоприятных условиях существования. Споры могут длительное время находиться в природе, а следовательно, долго сохранять субстрат генетической информации исходных клеток (геном) и тем самым обеспечивать передачу основных свойств потомству последующих генераций. Спорообразование происходит в средах с нейтральной пли слабощелочной реакцией при дефиците белковых веществ. Споры образуются в физиологическом растворе, дистиллированной воде, в нефиксированных мазках. Установлено, что этот процесс происходит быстрее в среде, содержащей чистый кислород, чем при аэрации культуры атмосферным воздухом. Образованно спор начинается с того момента, когда в среде соотношение форм белкового и минерального азота сдвигается в сторону преобладания последнего (Егоров и Сиицин, 1961). Добавление к среде нейтрального щавелевокислого натрия активизирует спорообразование, а 1%-лого раствора хлористого кальция -- подавляет. Споры не образуются в средах, богатых белковыми веществами, например в крови и сыворотке крови, в живом организме и невскрытом трупе. При нарушении целостности трупа возможно спорообразование.[1] Вегетативные клетки, образующие споры (спорангии), содержат по одной споре, расположенной центрально или субтерминально. Диаметр споры не превышает ширину бациллы. Формирование споры начинается в момент перехода вегетативной клетки к стационарной фазе роста, при этом наблюдается ряд последовательных стадий:

1. В клетке формируется  два нуклеоида, которые вскоре  объединяются в палочковидное  образование.

2. В одном участке клетки  появляются выпячивания клеточной  мембраны с мезосомой. Они формируют  поперечную перегородку, которая  отделяет свободную от липопротеиновых  зерен часть цитоплазмы и ДНК  от остального содержимого клетки. В результате этого изолируется  участок будущей споры, окруженный  мембраной.

3. Изолированный участок  окружается мембраной клетки; образуется  проспора с двойной мембраной.

4. Пространство между  споровой и клеточной (второй) мембранами расширяется, содержимое  его становится гомогенным, возникает  так называемый кортекс, благодаря  которому спора более заметна  при микроскопическом исследовании.

5. Вокруг наружной мембраны, покрывающей кортекс, формируется  оболочка. Из всех структур споры  она отличается наибольшей способностью  рассеивать электроны. Затем споровая  оболочка покрывается более рыхлым  и тонким слоем -- экзоспориумом.  Сформированная спора выходит  из бациллы через разрыв участка  клеточной стенки. Внутри бациллы  споры не прорастают.