Шпаргалка по "Гендік инженерия"

Бакуловирус геномы 5’-AcMNP , 3’-AcMNP гомологты аудандарынан және полэидрин белогын синтездеуші геннен тұрады. Біз қажетті генді сол полиэдрин генінің орнына енгіземіз. Насеком клеткасына енгізу трансфекция арқылы жүзеге асады. Ол 5’-AcMNP және 3’-AcMNP гомологты аудандары арқылы жүзеге асады. Демек бізде полиэдрин генінің орнына қажетті ген орналасады.

Ал трансфекцияланған клеткаларды анықтау үшін PNPGal бар ортада өсіреміз. Сол кезде клеткалардың бір бөлігі көк түске боялады, ал бір бөлігі боялмайды. Сол боялмаған клеткалар трансфекцияланған клеткалар болып табылады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

30. Бакуловирус  геномы негізінде бөгде генді  клондау және экспрессиялау мүмкіндігін  және  Вас-to-Bac гибридті бакуловирус жасау жүйесін сипаттаңыз 

Бакуловирус-омыртқасыздарды инфекциялайтын вирус. Геномы- сақиналы қос тізбекті ДНҚ. Мөлшері 88-160 мың н.ж. Бұл вирус инфекциялағаннан кейін 30-52 сағат аралығында көбейеді, инфекциялағаннан кейін 5 тәуліктен кейін сыртқа шығады. Оның вироидтары полиэдрон қабығымен қапталып тұрады.Оның ұзындығы 250-400 нм, диаметрі 50-100 нм. Полиэдрон қабаты полиэдрин белогынан тұрады.

Бакуловирус геномы негізінде бөгде генді клондау үшін Аутофагия калифорния (AcMNP) штамы қоданылады.

 

 

Осы штамннан тасымалдаушы вектор жасаймыз. Оның құрамында  5’-AcMNP және 3’-AcMNP гомологты ауданы, полиэдринді синтездеуші геннің промотері, қажетті ген, терминатор және селективті маркерлік ген болады.

Бакуловирус геномы 5’-AcMNP , 3’-AcMNP гомологты аудандарынан және полэидрин белогын синтездеуші геннен тұрады. Біз қажетті генді сол полиэдрин генінің орнына енгіземіз. Насеком клеткасына енгізу трансфекция арқылы жүзеге асады. Ол 5’-AcMNP және 3’-AcMNP гомологты аудандары арқылы жүзеге асады. Демек бізде полиэдрин генінің орнына қажетті ген орналасады.

Ал трансфекцияланған клеткаларды анықтау үшін PNPGal бар ортада өсіреміз. Сол кезде клеткалардың бір бөлігі көк түске боялады, ал бір бөлігі боялмайды. Сол боялмаған клеткалар трансфекцияланған клеткалар болып табылады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

31. Өсімдіктер  гендік инженериясы.Өсімдік клеткаларының  агробактериялық трансформациясының  молекулалық-генетикалық механизмін  сипаттаңыз

Өсімдіктер қоршаған ортаның көптеген қолайсыз факторларының әсеріне: жоғары және төмен температура, ылғалдың жетіспеушілігі, топырақтың тұздануы, ауаның газдануы, минералдық заттардың жетіспеушілігі немесе, керісінше шектен тыс көбеюі т.б тап болады..

 Кейбір жағдайда гендік  инжинерия арқылы өсімдіктердің  төзімділігін арттыруға болады. Мысалы абиотикалық факторлардың  өсімдіктердің метаболиттік реакциясын  бақылайтын жеке гендермен әрекеттер  жүргізуге жағдай бар.

Генетикалық өзгертілген немесе генетикалық модификацияланған өнімдер – бұл ДНҚна ерекше табиғаттан берілмеген ген енгізілген өсімдіктерден алынған өнімдер. Олардың арқасында бойында әр түрлі жаңа қасиеттер пайда болады.

Гендік инженерия жұмысы мынандай кезеңдерден тұрады:

1. Басқа организмге көшірілетін құрылымдық гендерді алу;

2. Оны вектордың құрамына енгізу, яғни рекомбинанттық ДНҚ жасау;

3. Рекомбинанттық ДНҚын өсімдік клеткасына тасымалдау;

4. Өсімдік клеткаларында бөтен ДНҚның экспрессиясын талдау;

5. Геномы өзгерген жеке клеткалардан регенерант өсімдігін алу.

Ісікті  қоздыратын  агент Агробактерияның  плазмидасы, оны Ті- плазмида  д е п  атайды. Ti- плазмида – бұл Agrobacteria tumefaciens  топырақты бактерияның плазмидасы және өсімдіктердің ісік ауруын қоздыратын агент болып табылады.  Бұл бактерия өсімдіктің жарақаттанған ұлпасы арқылы жасушаға кіргенде өзінің гендерін бірге ала келіп, өсімдік геномына енгізеді. Өсімдіктің жарақаттанған бөлігі арқылы ену себебі жарақаттанған өсімдіктен ацетосирингон және гидроксиацетосирингонды бөліп шығарады.Олар біздегі вирулентті генді активтендіреді. Бактерияның ісік тудырушы гені өсімдік геномына енгеннен соң өсімдікте жаңа ақуыздар синтезделе бастайды.   Нәтижесінде бактерия гендерін қабылдаған өсімдік жасушалары өте тез көбейіп, тамыр мойынында ісік, бұлтық пайда болады.  Бұл инфекция үдерісі  шын мәнісінде табиғи гендік инженерия.

Ті-плазмида бактерия клеткаларында өздігінен репликациялана алады. Америка генетиктары 1977 жылы анықтады, тәж тәрізді ісіктер өсімдік хромосомасының  құрамына Ті-плазмиданың белгілі бір бөлігінің енуі арқасында пайда болатындығын. Ісік жасушаларында сау жасушаларда болмайтын опиндер деген жаңа классқа жататын химиялық заттар табылды. Опиндер-ол аргинин амин қышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендер: октопин- аргинин мен пирожүзім органикалық қышқылының туындысы, нопалин- аргинин мен a кетоглутараттың туындысы, агропин – қант пен глутамин қынқылының туындысы. Ауру туғызған бактерияның штамына байланысты ісік жасушалары октопинді немесе нопалинді ситездейді.

Ті-плазмидалар өздерінің құрамында жазылған  опин түрі бойынша жіктеледі. Т-ДНҚ-ны  өсімдік клеткасына тасымалдау және хромасомалық Т-ДНҚ құрамына кірістіру процесіне жауапты VIR-гендер плазмида бойында Т ДНҚ дан алшақ орналасады. Сол сияқты опиндерді ыдырататын гендер де Т ДНҚ дан алшағырақ орналасады.

Ті-плазмидада Т-ДНҚ екі ұшынан да бір-бірінен аумайтын, ұқсас ұзындығы 25 нуклеотидтердің жұбынан тұрады.

Ті-плазмидасы негізіндегі векторлар.

Ті-плазмиданы вектор ретінде пайдаланудың бір қиыншылығы, оның көлемінің үлкенділігі- 200-800 м.н.ж. Т-ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымалдау және хромасомаға тіркестіру үшін онымен шекаралас жатқан нуклеотидтер тізбегінің және де оған қоса ісік тудыратын вируленттік (vir) бөлігінің қажет екендігі анықталған. Сондықтан, қазір бүтін Ті-плазмиданы толығымен емес, тек оның жоғарыда аталған vir бөлшегін ғана пайдаланады.

Бірінші әдіс- «екіаралық векторлар» әдісі- ішек таяқшасы бактериясының (E.coli) pBR322 -плазмидасын қолдануға негізделген. Рестриктазамен Т-ДНҚ Ті-плазмидадан кесіп алып, pBR322- плазмидаға тіркестіріледі, лигаза ферментімен тігіледі. Одан кейін сол Т-ДНҚ қосылған pBR322-плазмиданы E.coli клеткасына кіргізіп, бактериялардың көбеюіне жағдай жасайды. Содан соң көбейген плазмидаларды бактериялардан бөліп алады. Құрамында Т-ДНҚ бар клондалған бактерия плазмидасына көзделген мақсатқа сай бөтен құрылымдық генді орналастырады. Осы плазмидадан, Т-ДНҚ-дан және бөтен құрылымдық геннен құрастырылған рекомбинанттық ДНҚ-ны көбейту керек. Ол үшін оны E.coli клеткасына енгізіп бактерияларды өсіреді. Сол кезде рекомбинанттық ДНҚ да көбейеді. E.coli биомассасынан рекомбинанттық ДНҚ-сы бар плазмиданы, яғни екіаралық векторды көп мөлшерді бөліп алады.

Екінші әдіс- бинарлық векторлар жүйесін қалыптастыруға негізделген. A. tumefaciens арқылы өсімдіктерге ісік ауруларын жұқтырып, оларды трансформациялау үшін бүтін Ті-плазмида емес, оның екі бөлшегі ғана жеткілікті. Біріншісі- Т-ДНҚ-ның екі жағындағы тек шекаралық бөліктер, екіншісі- Ті-плазмиданың вируленттік (vir) бөлігі. Егер агробактериялардың бір плазмидасында vir бөлігі болса, ал екіншісінде Т-ДНҚ бөлігі болса, олар өсімдік клеткаларын трансформациялауға қабілетті. Сонымен Т-ДНҚ-ның құрамына қандай да бөтен ген ендірілсе, сол өсімдік геномына тіркесе алады. Бірақ солай болғанның өзінде де, Ті-плазмидалық векторлар арқылы өсімдікке енгізілген бөтен гендердің экспрессиясы өтпейді. Мысалы, темекі геномына Ті-плазмидалық векторлар көмегімен өз промоторларымен бірге енгізілген бактерия (антибиотикке қарсы ферменттер гендері), жануар мен өсімдік (леггемоглобин гені) гендерінің экспрессиясы жүрмеген.

 

 

 

32. Трансгенді  өсімдіктер.   Ті –плазмидасы және оның мутанттары. Ті-плазмидасы негізіндегі векторлық жүйелерді сипаттаңыз

Агробактерия  - топырақта мекендейтін бактериялардың тобы. Олар өсімдіктерге жұғып тәж тәрізді өсіндіні, яғни ісікті, бұлтықты пайда болғызады. Бұл бактерия өсімдіктік жарақат- танған ұлпасы арқылшы клеткаға кіргенде өзінң гендерін бірге ала келіп, өсімдік геномына енгізеді. Соның салдарынан өсімдікті жаңа белоктарды синтездеуге мәжбұр еткізеді. Нәтижесінде бактерия гендерін қабылдаған өсімдік клеткалары өте тез көбейіп, тамыр мойынында (тамыр мен сабақтын арасында) ісік, бұлтық пайда болады.

Бұл инфекция процесі шын мәнісінде табиги гендік инженерия. Ісікті қоздыратын агент осы бактерияның плазмидасы, оны Ті- плазмида деп атайды . Бұл плазмидалар сақина тәрізді массасы 1,2х108 қД (агробактерия хромосомасының көлемінің 3-5%) ДНҚ молекулалары. Олар бактерия клеткаларында өз бетімен репликацияланып көбейеді.

Американ генетиктері 1977 жылы анықтағандай, тәж тәрізді ісіктер өсімдік хромосомасының құрамына Ті-плазмиданың белгілі бір бөлігінің кіруі арқасында пайда болады. Бұл фрагментті Т- ДНҚ деп атайды..

Ісік клеткаларында сау клеткаларда болмайтын опиндер деген жаңа классқа жататын химиялық заттар табылды. Опиндер - ол аргинин амин қышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендер: октопин - аргинин мен пирожүзім органикалық қышқылының туындысы, нопалин - аргинин мен а-кетоглутараттың туындысы. Ауру туғызған бактерияның штаммына байланысты ісік клеткалары октопинді немесе нопалинді синтездейді

Ті-плазмидалар өздерінің құрамында жазылған  опин түрі бойынша жіктеледі. Т-ДНҚ-ны  өсімдік клеткасына тасымалдау және хросасомалық Т-ДНҚ құрамына кірістіру процесіне жауапты VIR-гендер плазмида бойында Т ДНҚ дан алшақ орналасады. Сол сияқты опиндерді ыдырататын гендер де Т ДНҚ дан алшағырақ орналасады.

Ті-плазмидада Т-ДНҚ екі ұшынан да бір-бірінен аумайтын, ұқсас ұзындығы 25 нуклеотидтердің жұбынан тұрады. Ол нуклеотид тізбектерінің, мүмкін, Т-ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымал- дауына қатысы бар шығар. Ісіктің пайда болуына Ті-плазмида дәл өзі себепші екені (хромосомалық гендер емес), плазмидалары жоқ немесе мутанттық Ті-плазмидалары бар агробактерия штамм- дарын қолдану арқылы дәлелденді. Ті-плазмидалары жоқ агробак- териялар жұққан өсімдіктерде ісік пайда болмайды және де опин- дер синтезі өтпейді. Мутантармен өткізілген генетикалық зерттеулер көрсеткендей, Ті-плазмиданың Т-ДНҚ фрагменті гана ісіктің пайда болуына, опиндер синтезіне және дифференцияланудың тежелуіне жауапты.

Ісік тудыратын қабілеті төмен мутант - октопин түзгіш плазмида алынған. Оның бағалылығы, ол ісік ұлпасына жақын орналасқан нормалы клеткалардың аномальдік дифференцировкасын арттырады. Мысалы, тамыр мен өркеннің күшті өсуіне себепкер болады. Осы плазмидамен трансформацияланған темекі клеткалар популяциясында кейбір жеке клеткалар (өте сирек болса да) регенерант өсімдігін берген. Бұл өсімдіктердің барлық ұлпалары октопинді синтездеу қабілетін Т-ДНҚ-ның болуы нәтижесінде сақтаған. Осы трансформацияланған өсімдіктерді нормалы темекі өсімдігімен будандастырып, кейіннен сол буданнан алынған ұрықтарды өсірген. Сонда көрсетілгендей, октопин синтездеуге қабілеттілік (яғни Т-ДНҚ) Мендель заңдылығына сәйкес анальқ және аталық жағынан да тұқым қуалаған. Демек, Т-ДНҚ хромосомаға тіркескеннен кейін өсімдіктің әдеттегі гені болып сіңіп кетеді.

Ті-плазмидасы негізіндегі векторлар.

Ті-плазмиданы вектор ретінде пайдаланудың бір қиыншылығы, оның көлемінің үлкенділігі- 200-800 м.н.ж. Т-ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымалдау және хромасомаға тіркестіру үшін онымен шекаралас жатқан нуклеотидтер тізбегінің және де оған қоса ісік тудыратын вируленттік (vir) бөлігінің қажет екендігі анықталған. Сондықтан, қазір бүтін Ті-плазмиданы толығымен емес, тек оның жоғарыда аталған vir бөлшегін ғана пайдаланады.

Бірінші әдіс- «екіаралық векторлар» әдісі- ішек таяқшасы бактериясының (E.coli) pBR322 -плазмидасын қолдануға негізделген. Рестриктазамен Т-ДНҚ Ті-плазмидадан кесіп алып, pBR322- плазмидаға тіркестіріледі, лигаза ферментімен тігіледі. Одан кейін сол Т-ДНҚ қосылған pBR322-плазмиданы E.coli клеткасына кіргізіп, бактериялардың көбеюіне жағдай жасайды. Содан соң көбейген плазмидаларды бактериялардан бөліп алады. Құрамында Т-ДНҚ бар клондалған бактерия плазмидасына көзделген мақсатқа сай бөтен құрылымдық генді орналастырады. Осы плазмидадан, Т-ДНҚ-дан және бөтен құрылымдық геннен құрастырылған рекомбинанттық ДНҚ-ны көбейту керек. Ол үшін оны E.coli клеткасына енгізіп бактерияларды өсіреді. Сол кезде рекомбинанттық ДНҚ да көбейеді. E.coli биомассасынан рекомбинанттық ДНҚ-сы бар плазмиданы, яғни екіаралық векторды көп мөлшерді бөліп алады.

Екінші әдіс- бинарлық векторлар жүйесін қалыптастыруға негізделген. A. tumefaciens арқылы өсімдіктерге ісік ауруларын жұқтырып, оларды трансформациялау үшін бүтін Ті-плазмида емес, оның екі бөлшегі ғана жеткілікті. Біріншісі- Т-ДНҚ-ның екі жағындағы тек шекаралық бөліктер, екіншісі- Ті-плазмиданың вируленттік (vir) бөлігі. Егер агробактериялардың бір плазмидасында vir бөлігі болса, ал екіншісінде Т-ДНҚ бөлігі болса, олар өсімдік клеткаларын трансформациялауға қабілетті. Сонымен Т-ДНҚ-ның құрамына қандай да бөтен ген ендірілсе, сол өсімдік геномына тіркесе алады. Бірақ солай болғанның өзінде де, Ті-плазмидалық векторлар арқылы өсімдікке енгізілген бөтен гендердің экспрессиясы өтпейді. Мысалы, темекі геномына Ті-плазмидалық векторлар көмегімен өз промоторларымен бірге енгізілген бактерия (антибиотикке қарсы ферменттер гендері), жануар мен өсімдік (леггемоглобин гені) гендерінің экспрессиясы жүрмеген.

 

33. Өсімдік клеткаларын   және протопластарды  агробактериялар арқылы трансформациялау әдістері. Өсімдіктерге трансгенді енгізудің тура әдісін түсіндіріңіз

Генетикалық  материалды өсімдік клеткаларына енгізу  әдістері:

1.клеткаларды агробактериялармен  бірге өсіру

2.протопластарға ДНҚ-ны  ПЭГ және Са2+ көмегімен енгізу

3.ДНҚ-ны липосомаларға салып тасымалдау

4.электропорация

5.электрофорез

6.микроинъекция

7.баллистикалық әдіс