Шпаргалка по "Гендік инженерия"

Гибридизация процедурасы аяқталғаннан  кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден  тазалайды, өйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзеп, гибридизация нәтижесін  бұзады.

Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады.

Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның  уақыты радиактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады.

 Сүзгідегі радиоактивті  ДНҚ бар орын фотопленкада  кішігірім қара дақ түрінде көрінеді.

Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі -ауторадиография деп аталады.

Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады.

Саузерн блотинг (англ. Southern blot) — сынамадағы ДНК реттілігін анықтау үшін қолданылатын әдіс.Саузерн блоттинг әдісі гибридизациялау үшін  ДНК ны мембраналық фильтрге  ауыстыру  мақсатында агарозалық гельдегі электрофорезге негізделген.Әдіс ағылшын биологы Эдвин Саузерн атымен аталады.

Нозерн-блот (англ. Northern blot) — сынамадағы РНҚ молекулалары мен олардың фрагменттерін  зерттеуге негізделген зерттеу әдісі.

 Нозерн Блотинг әдісін  1977 жылы Стендфорд университетінің  ғалымдары  Джеймс Олвайн, Дэвид  Кемп және Джордж Старк ұсынды.

Нозерн-блот пен  Саузерн-блот негізгі айырмашылығы  анықталатын субстрат ДНК емес,  РНК.

 яғни бұл әдісте  —нитроцеллюлозалы фильтр орнына  диазобензилоксиметил-целлюлозды фильтр қолданылады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

23. Бөгде геннің  трансляция өнімін анықтау әдістерін сипаттаңыз

Қажет   генді барлық   бактериялар массасынан   алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда   бактерияның әрбір жеке   клеткасы жеке ұрпақ береді   яғни бактериялық шоғыр түзіледі.

Енді гендер жинағын яғни  әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы   аз болған сайын одан қажет генді табу оңай.

Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы   әдістер қолданылады. Кең   тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады.

1. Шоғырларды гибридизациялау 

Ол үшін   Петри    шынысындағы  негативтік   шоғырларға (рДНҚ-сы бар   бактериялар) нитроцеллюлозалы   сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар   агарды бірнеше жерден   инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, нитроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады.

Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі сүзгіні радиоактивті зондпен өңдеу.

 Зонд (сүңгі) дегеніміз іздеп жатқан ген бөлігінің азоттық негіздеріне комплементарлы кішігірім ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Сүңгі әр уақытта радиоактивті изотоппен белгіленеді.  Сүңгіні синтездеу үшін геннің немесе белоктың ең болмағанда кішігірім бөлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек. Олардың амин қышқылдар тізбегі бойынша және генетикалық кодтың көмегімен геннің  бөлігін кодтайтын нуклеотидтор тізбегін оңай алуға болады. Алайда, кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, сондықтан белоктың белгілі тізбегінен метионин және триптофан амин қышқылдары (олардың бірден ғана кодондары бар) болатын бөліктерінен синтетикалық олигонуклеотид — синтезделеді.

Табиғи сүңгі ретінде қажет геннің функциясы қарқынды өтетіні белгілі клеткадан әр түрлі жолдар арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады.

Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Сүңгі тек өзіне комплементарлы генмен ғана байланысады. Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридизация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым көтеріңкі емес, өйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі өзінің ДНҚ-сын тауып үлгіруі үшін). Гибридизация процедурасы аяқталғаннан  кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден  тазалайды, өйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзеп, гибридизация нәтижесін  бұзады. Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның  уақыты радиактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады. Сүзгідегі радиоактивті ДНҚ бар орын фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде көрінеді. Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі -ауторадиография деп аталады. Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады.

Антиденелер— адам мен жануарлар организміне енген жат бөгде ірі молекулалы протеиндік заттарға (антигендерге) қарсы иммундық реакциялар нәтижесінде түзіліп, олардың зиянды әсерлерін жоятын протеиндік заттар (негізінен гамма-глобулиндер); адам және жылықанды жануарлар денесінде пайда болған антигендерге қарсы қан плазмасында түзілетін ақуыздық заттар. Антиденелер ағза иммунитетін күшейтуде маңызы үлкен. Антиденелерді лимфоциттер мен плазмоциттер бөледі. Антиденелерге тән қасиет — тек өздерінің түзілуіне әсер еткен антигендермен ғана әрекеттесіп, оларды жояды. Антиденелер — организмде қан сарысуы мен ұлпаларда жинақталады. Антиденелер  антигендермен әрекеттесу сипатына қарай агглютининдер, гемолизиндер, бактериолизиндер, преципитиндер болып бірнеше топтарға бөлінеді

Бірінші реттік антиденелер(primary antibodies) -  Иммунологиялық анализ барысында нысана молекуламен байланысатын  антиденелер(мысалы Имунноферментативті анализ әдісімен).

Екінші реттік антиденелер–антиген-антидене біріншілік комплексін көру үшін(визуализация) қолданылады

Кез келген иммуногистохимиялық әдістің маңызды кезеңі  «антиген-антидене» реакция нәтижелерін көру болып табылады. Антигендермен байланысқан антиденелерді әр түрлі антиденелердің Fc-фрагментімен байланысқан белгілерді пайдаланып анықтауға болады. Мысалы:

- флюорохромдар;

- ферменттер;

- металл және  металлопротеидтер;

- радиоизотоптар;

- аралық байланыстырушы заттар, мысалы, биотин, дигоксин, дигоксигенин.

Берілген белгілер бірінші реттік антиденелермен қатар екінші реттік антиденелермен коньюгациялана алады. Егер белгі бірінші реттік антиденемен  байланысқан болса, бұл әдіс «тура әдіс» деп аталады.  Бұл бақылаудың (визуализация) ең қарапайым әдісі, бірақ сезімталдылығы өте төмен, себебі бір антигенге бір белгіден келеді.

Әдістің сезімталдығы «тура емес» әдісте артады: бұл әдісте белгірелді бірінші реттік антиденелер емес екінші реттік антиденелер тасымалдайды, оларға бірінші реттік антиденелер антиген болып табылады. Мысалы: егер бірінші реттік антиденелер тышқандардан алынса, екінші реттік антиденелер  қояндікі болуы мүмкін, олар тышқанның иммуноглобулиндерінің  Fc-фрагментіне сецификалық болып келеді.

Сонымен қатар реакцияға тағы бір кезең қосылады, бұл әдістің артықшылығы бар: екінші  реттік антиденелер  басқа жануардың Fc-фрагментіне қарсы  алу жеңілірек, сонымен қатар оларға белгіні байланыстыру оңай. Біріншілік антиденелер артық жүк тасымалдамайды, яғни , ұлпаларға оңай әрі тез өтеді, белгі антидене-антиген ара қатынасынан кейінгі конформациялық өзгерістеріне әсер етпейді.

Иммуноблоттинг (вестернблоттинг) – Иммуноферментативті анализге негізделген (ИФА) белоктарды анықтаудың   сезімталдылығы жоғары әдісі. Бұл әдіс белоктық антигендерді зерттеу әдісі. Белоктарды  электрофорез көмегімен бөледі де мембранаға тасымалдайды.  Одан кейін мембрананы антедене ерітіндісінде инкубациялайды, байланысқан антиденелерді радиоизотопты және иммуноферментативті анализ арқылы анықтайды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

24. Полимераздық тізбектік реакция, оның этаптары мен реакция компоненттері. ПТР әдісінің қолданылу аясы

Полимеразалық тізбекті реакция (ПТР) – биологиялық сынамадағы нуклеин қышқылдарының белгілі-бір фрагментінің аз ғана концентрациясын көбейтуге мүмкіндік беретін молекулалық биологияның экспериментальдық әдісі.

ПТР ДНҚ-ны амплификациялауда ғана емес, сондай-ақ нуклеин қышқылдарымен әртүрлі манипуляция жасауға (мутацияға кіріспе, ДНҚ фрагменттерін көбейту және т.б.) мүмкіндік береді және биологиялық медициналық практикада кеңінен қолданылады, мысалы, әртүрлі ауруларды анықтауда (тұқым қуалайтын, жұқпалы аурулар), установления отцовства, гендерді клондауда, жаңа гендерді бөліп алуда кеңінен қолданылады.

Полимеразалық тізбекті реакцияны (ПТР) 1983 жылы американдық биохимик Кэри Муллис ашқан. Оның басты мақсаты берілген ДНҚ фрагментін ДНҚ-полимераза ферментінің қатысында бірнеше қайтара ДНҚ-ны амплификациялау нәтижесінде көптеген көшірмелерді алу болды.

ПТР әдісі белгілі ДНҚ фрагментін in vitro жағдайында ферменттердің қатысуымен бірнеше қайтара таңдамалы түрде көшіруге негізделген. ПТР тірі организмдерде жүзеге асатын ДНҚ амплификациясынан (репликация) ерекшелігі ДНҚ-ның қысқа тізбекті үзінділері көшіріледі. Қалыпты ПТР-процессінде ДНҚ үзінділерінің ұзындығы 3000 жұп нуклеотидті құрайды. Әртүрлі полимеразалық қоспалардың көмегімен және әртүрлі қоспалардың көмегімен белгілі бір жағдайларда ПТР-фрагменттерінің ұзындығы 20-40 мың жұп нуклеотидке дейін жетуі мүмкін.

Реакция компоненттері

• Амплификациялауға қажет ДНҚ фрагменті бар – ДНҚ марица;

• Қажетті ДНҚ фрагментінің әртүрлі ұштарына комплементарлы – екі праймер;

• Полимеразалық реакцияларды катализдейтін термотұрақты фермент – ДНҚ-полимераза; ПТР-ді жүзеге асыру үшін қажетті ДНҚ-полимераза жоғары температурада да өзінің активтілігін сақтап қалуы керек. ПТР-ге қажетті ДНҚ полимеразалар термофильді бактериалардан бөлініп алынған: Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) және т.б.

• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаттар (dATP, dGTP, dCTP, dTTP);

• Полимеразаның жұмысына қажетті Mg2+ ионы.

• Реакцияға қажетті жағдайларды (рН, ерітіндінің иондық күші) қамтамасыз ететін – буфер ерітіндісі. Құрамында тұздар мен бұқаның қан сарысу альбумині болады.

Сондай-ақ ПТР реакцияларының ингибиторлары ретінде пирофосфаттар қолданылуы мүмкін.

Праймерлер

ПТР-ді жүзеге асыру матрицалық ДНҚ мен праймер арасында комплементарлы комплекс түзуге негізделген. Праймерлер – ұзындығы 18-30 нуклеотид негізінен тұратын синтетикалық олигонуклеотидтер. Әр праймер амплификациялауға қажетті матрицалық ДНҚ фрагментінің екі тізбегіне коплементарлы болып келеді және амплификацияланатын участоктың басын және аяғын шектеп отырады.

Праймерлерді таңдау кезінде келесі критерийлерді ұстану керек:

• GC-құрамы ~ 40—60%;

• Шпилка мен димерлер болмау керек;

• 3’- соңында гуанин немесе цитозин болғаны дұрыс, себебі бұлардың арасында үш сутектік байланыс түзіледі.

Амплификатор – ПТР жүргізуге арналған аппарат. Амплификатор – периодты түрде қыздыру және суытуды қамтамасыз ететін прибор.

ПТР жүргізу үшін 20-35 цикл жүргізіледі. Әрқайсысы үш сатыдан тұрады: денатурация, гибридизация немес жасыту, элонгация.

Денатурация

Қостізбекті  ДНК матрицасын жарты –екі минутқа 94-96 градусқа дейін қыздырады ,содан кейін  ДНк тізбектері ажырайды.Бұл саты денатурация деп аталады.денатурация кезінде ДНк-ның қос тізбектерінің арсындағы сутектік байланыс үзіледі.матрица мен праймердің толық денатурациялануы үшін  полимеразаны қоспас бұрын алдын ала қоспаны екі –үш минут қыздырады.

Гибридизация немесе жасыту.Тізбектер ажырағанда температураны төмендетеді, сонда реакциядағы бөгде заттардың саны азаяды. праймерлердің бір тізбекті матрицамен байл. байланысуы жасыту сатысы деп аталады.жасытудың температурасы праймердің құрамына және балқуына байланысты болады.

Жасытудың температурысы дұрыс таңдалмаса, праймер мен матрицаның байланысуына кері әсер етеді.жасытудың уақыты отыз секундта жүреді, осы уақытта полимераза көптеген нуклеотидтерді синтездеп үлгереді.  Сондықтан праймерлердің балқу температурасы алпыс градустан жоғары таңдалуы керек және жасыту мен элонгация сатылары бір уақытта алпыс -жетпіс екі градуста жүргізілуі керек. Элонгация.ДНК полимераза матрицалық тізбекті праймер көмегімен репликациялайды.полимераза екінші тізбектің синтезін праймердің 3'соңынан бастайды.

ПТР ді жүргізу барысында ең алдымен термиялық денатурация жүргізіледі. Денатурация кезінде қос тізбекті ДНК жеке жеке тізбектерге ыдырайды. Ол 93-95 0 та жүзеге асады. Кейін сынама 60 0 қа дейін суытылады. Бұл тізбектердің праймермен байланысуына жағдай туғызады. Праймерлер қос тізбектің қайтадан байланысып қалмауын қамтамасыз етеді. Кейін  сынаманы 70 0  қа жеткізеді. Бұл температура Taq – полимеразаның (Термотұрақты ) активтелуіне акеледі.

Праймерлерді таңдау.Праймерлерді әдетте химиялық синтез арқылы бөліп алады. Оны амплификацияланатын ДНК  бөлігінің  шеткі нуклеотидтер тізбегін алдын ала анықтап соған сәйкестендіреді.

Егер алдын ала керекті тізбектерді анықтау мүмкіндігі болмаса  онда кездейсоқ праймерлер алынады. Оларға қойылатын шарт ДНК мен байланысуға қабілетті болу керек.

 Праймерлер көбінесе 3’ соғына жалғанады. Праймерлердің  басты қызметі ДНК полимераза  қызметін шектеу, яғни тек қана  керекті нуклеотидтер тізбегін  синтездеуге көмектеседі.

ПТР реакциялары  көбінесе  циклды. ПТР циклын бірнеше рет қайталағанда керекті нуклеотид тізбектерінің (ген)  өте көп мөлшерде алуға болады.

25. Рекомбинантты  ДНҚ молекуласын клондаудың жалпы  бейнесін көрсетіңіз

1.Рекомбинантты. ДНҚ-ны клеткаға енгізу. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілі векторға байланысты. Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда енгізу трансформация типімен, егер фаг қолданылса, онда трансфекция (клетканың фаг ДНҚ-сы арқылы инфекциялануы) типімен өтеді. Трансформация мен трансфекцияның жалпы жолы бактерия клеткасын кальций тұздарымен   (Са С12) өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындығына негізделеді. Экзогенді (бөтен) ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала СаСІ2-мен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 104—105 плазмиданың біреуі ғана клетканың ішіне енеді яғни   бактериялардың азғантай бөлігі   ғана