Шпаргалка по "Гендік инженерия"

2.Сэнгер әдісі «тізбекті  үзу» әдісі деп аталады. Яғни  ДНҚ-полимераза арқылы түзілетін  комплементарлы ДНҚ-ның синтезі Максам-Гилберт әдісіне сәйкес әрбәр негізде тоқтайды. (үзіледі).Ал, ДНҚ-полимераза үшін ашытқы (праймер) керек, ол үші фектордың 17-мүшелік тізбегіне комплементарлы олигонуклеотид синтезделеді.

Егер олигонуклеотид-ашытқыны матрицалық ДНҚ-мен байланыстырып, ДНҚ-полимераза мен дезоксинуклеозид-трифосфаттарды қосса, онда ДНҚ бөлігінің толық көшірмесін ала аламыз. Мұнда әрбір келесі азоттық негіз өсіп жатқан тізбектің 3'— ұшының гидроксил тобына жалғанатынына мән беру керек. Сэнгер әдісі үшін ДНҚ бөлігінің толық көшірмесі емес, оның үзінділері қажет.

         Матрица-ашытқы комплексін төрт  бөлікке бөледі   де, олардың  әрқайсысына тізбектің 3'— ұштары  азоттық негіздерінің     аналогтары — дидезоксинуклеозидтрифосфаттарды (ddNТФ) қосады. Мұндай дидезоксинуклеозидтердің рибоза қалдығының көміртегі атомдарында гидроксил тобы болмайды, сондықтан өсіп жатқан 3'— ұшының синтезін белгілі негізден кейін тоқтайды. Мысалы, тимидинмен аяқталатын ДНҚ фрагменттерін алу үшін ортаға дидезокситимидинтрифосфатты, тізбекті аденозин бойынша үзу үшін дидезоксиаденозинтрифосфатты және т.с.с. қосады. Әрине, төрт бөліктің әрқайсысына қалыпты  дезоксинуклеозидтрифосфаттардың бірін (dТТФ, dАТФ,   (dЦТФ және dГТФ) қосу керек. Нәтижесінде ұзындығы әр түрлі, бірақ 3'— ұштары бірдей олиго — және полинуклеотидтер жиынтығын алады. Олардың электрофореграммасын радиоаутография әдісі арқылы оқып, геннің нуклеотидтер қатарын анықтайды.

Максам-Гилберт және Сэнгер әдістеріе қолданып, РНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын да анықтауға болады. Бұл әдістердің осы заманғы молекулалық биология мен гепетика үшін маңызы зор. Оларды пайдалану арқасында қазіргі кезде көптеген вирустар, бактериялар және олардың плазмидалық элементтері геномдарының алғашқы құрылымы анықталды. Нуклеотидтері белгілі гендердің ұзындығы 6 млн. асьш кетті. Қазіргі кезде кейбір митохондрия мен хлоропластардың ДНҚ құрылымы толық белгілі болды, олардың ДНҚ молекуласының ұзындығы 150 н. ж. асып түсті.

Осы заманғы генетикалық инженерияның жетістігін адам геномына инструменттік шабуыл басталуынан байқауға болады. Адам ДНҚ-сының нуклеотидтер қатарын анықтауды АҚШ ғалымдары тікелей қолға алуда. Адамның ДНҚ-сы 3 млрд. нуклеотидтерден құралған, сондықтан олардың орналасу қатарын анықтау көп қаражатты және көптеген ғылыми генетикалық зертханалардың бірігіп жұмыс істеуін керек ететін аса күрделі іс болып саналады. Кейбір ғалымдардың есебі бойынша 3—6 млрд. доллар (әр нуклеотидке 1 — 2 доллар) жұмсап, адам геномының проектісін 15—20 жыл аралығында шешуге болады. Қазіргі кезде нуклеотидтерді анықтау жылдамдығын көбейтіп, жұмсалатын қаржыны азайту (әр нуклеотидке 50 цент жұмсау) жолдары талқылануда. Мысалы, Сэнгер бойынша нуклеотидтер қатарын анықтаудың автоматты әдістері құрастырылды, мұндай жаңа автоматты приборлар адам геномының оқылуын жеңілдетеді деп күтілуде.

 

 

 

 

 

 

 

14. Бактериялық  плазмидаларға жалпы түсінік  және олардың вектор ретінде  қолданылуы үшін қойылатын шарттарды  көрсетіңіз

Вектор деп-бөтен генетикалық материалды клеткаға тасымалдауға қабілетті ДНҚ молекуласын айтады. Векторлар ген тасымалдағыштар. Векторларға қойылатын талаптар: 1. Вектор клетка ішіне өзімен бірге бөтен генді алып кірген соң , репликациялана алатын болуы керек, сонда ғана ол келесі ұрпақта тұқым қуалай алады, ол үшін векторға ДНҚ репликациясын бастайтын ерекше нуклеотидтер тізбегін енгізеді. 2. Құрамында рестриктазаларды танып, үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек, әйтпесе векторға ДНҚ фрагментін енгізу мүмкін емес. 3. Оның құрамында 1 немесе бірнеше таңбаланған гендері болуы керек, сол таңбалар бойынша қажет геннің қай клетка ішіне енгенін анықтайды. 4. Вектордың клетка ішіндегі көшірмелері жеткілікті мөлшерде болуы керек. Вектор ретінде мөлшері 15-20 мың н.ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н.ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмида дегеніміз-геномдық ДНҚ-ға тәуелсіз, репликациялануға қабілеті бар қос тізбекті сақиналы ДНҚ-ны айтамыз. Түрлері: R плазмидалар-антибиотиктерге төзімді гендері бар, F-плазмидалар-плазмиданы 1клеткадан, 2 ші клеткаға өтуін қамтамасыз ететін гендері бар, диградация-сирек кездеседі, криптикалық-қызметі белгісіз.

 

 

 

15.рBR322 плазмидалық векторының құрылысы және вектор негізіндегі клондаудың  жалпы бейнесі

Вектор ретінде мөлшері 15— 20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмидалар бактериялардың хромосомадан тыс генетикалық элементі екендігін және олардың сипаттамасын біз қарастырған болатынбыз. Плазмидалық векторлар генді бактерияларға тасымалдап, оның тиімді жұмысын қамтамасыз ете алады.

Генетикалықинженерияда Е. Соlі бактериясы   үшін көптеген векторлық плазмидалар құрастырылды. Олардың ішінен әсіресе СоlЕ1 плазмидасының туындылары кең таралды. Ф. Болвар   және Р. Родригес құрастырған  осындай плазмида — рВR322   бірнеше мың жұп   негіздерден (4362 н. ж.) құралған. Бүл плазмидада антибиотиктер — ампициллин мен тетрациклинге төзімділіктің гендері бар және бірнеше рестриктазалар үзе алатын сайттары (нуклеотидтік нүктелері) бар рВR322 плазмиданың құрамында екі плазмида (рМВ1 және рSС101) және Тn З транспозоны бар. Ампициллинге тұрақтылықтың генінде Pst1 рестриктазасына арналған сайтқа және тетрациклинге тұрақтылық генінде ВаmН1 және SaL1 рестриктазаларына арналған қос сайтқа мән беріңіз. Осындай рестрикциялық сайттарда екі антибиотиктерге төзімділік гендерінің болуы қажет ДНҚ-сы (бөтен ДНҚ-сы) бар плазмидаларды сұрыптап алуға мүмкіндік береді.

Плазмиданы Ваm1 рестриктазасымен үзеді де,  босаған орынға бөтен ДНҚ молекуласын (олар да, алдын ала Ваm1 рестриктазасымен үзіледі) жалғайды, нәтижесінде рекомбинантты плазмида тетрациклинді ортада өсе алмайды, өйткені плазмиданың tet генінің біртұтастығы бұзылған. Керісінше, плазмида ампицилинді ортада өсе алады,  міне, осындай ортада көбейетін бактериялардан қажет генді оңай табуға болады. Бұл арада, вектор антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша таңбаланды.

pBR322 векторынан басқа  СоlЕ1 плазмидасы негізінде бірнеше  векторлар құрастырылған.Басқа плазмидалар (рSC101 т. б.) негізінде алынған векторлар  да белгілі.

СolЕ1 плазмидасы негізінде құрастырылған вектордың кемшілігі де бар: бөтен ДНҚ-ның молекулалық массасы артқан сайын рекомбинанттардың саны (копиялары) азая түседі. Осы себептен ұзын ДНҚ фрагменттерінің (10 мың. н.ж. асатын) клондарын алу үшін фагтық векторларды, космид және фазмидтерді пайдаланады.

 

 

 

16. l - бактериофаг  геномы негізіндегі векторлар. l - бактериофагының литикалық және  лизогениялық даму жолдарын сипаттаңыз

λ- бактериофагына қожайын клеткада 2 түрлі жолмен дамиды:

1) Литикалық жол- клеткада қоректік заттар аз болса, олар тез көбейе бастайды. Әр 20 минут сайын клетка қабығын ерітіп сыртқа шығады. 1000-ға дейінгә көшірмелер жасайды.

2) Лизогениялық жол- қоректік заттар жеткілікті, қолайлы жағдай туғанда.

λ- бактериофагы  ДНҚ ұзындығы шамамен 50 мың жұп нуклеотидтен тұрады, оның 20 мың жұбында ешқандай ақпарат жазылмаған.

Фагтық векторлар. Вектор ретінде фагпен қатар вирустар да қолданылады. Лямбда фагтың ДНҚ-сы қос тізбекті және формасы түзу,оның геномы 48,5 мың ж.н. тұрады. Фаг ДНҚ-сының 12 н.ж. құралған комплементарлы жабысқақ ұштары бар. Олар фаг клеткаға енгеннен кейін бір-бірімен бірігіп, ДНҚ сақиналы формаға айналады. Сақиналы ДНҚ репликациялық формада болып саналады. Лямбда фагтың ДНҚ молекуласында 60-тай ген бар. Фаг геномында лизистік даму мен ұрпағын көбейту үшін қажет гендері жоқ екі учаске бар. Бірінші учаске фаг геномының орталық бөлігінде орналасқан, оның ұзындығы 22,0 мың ж.н. тең, екінші учаске Р мен Q гендері арасында орналасқан, ұзындығы 3,0 мың ж.н. тең. Міне, осы бөліктерді бөтен ДНҚ молекуласымен ауыстыруға болады. Лямбда фагтың вектор ретінде кең таралуы осы қасиеті мен ерекшелігіне байланысты.

Кейінгі кезде  жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар фаг- М13 негізінде де жақсы векторлар алынады. Жетілген М13 фагының жалғыз ДНҚ молекуласының ұзындығы 6,5 мың ж.н. тең.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

17. Космидті векторлар  мен фазмиданың конструкцисы  мен сыйымдылығы, олардың  клетакаға ену және даму ерекшеліктерін көрсетіңіз

Космидтер  - лямбда фагтың cos  аймағы (жабысқақ ұштары) бар плазмида, яғни тіршілігі екі жақты ДНҚ-ның гибридті молекуласы. Оларды алғаш рет 1978ж Дж. Коллинз бен Б.Хон ашты.  Космидтің плазмидалық бөлігі  оның бактерияларда репликацияланына мүмкіндік береді, ал лямбда фактың геномына жататын бөлігі  - cos тізбек  - космидтің фаг капсидінің ішіне in vitro  жағдайында оралуына және реципиенттік клеткаға  трансдукциялануына мүмкіндік береді.   Сонымен, космидтер клеткаға  трансформация жолымен емес, кәдімгі инфекция арқылы ене алады. Мұның өзі  трансформация процесінің тиімділігін ең аз дегенде 100есе арттырады.  Жиі кездесетін космидті векторлар 4-6 м.ж.н тұрады, сол себепті Космидтік векторларда  мөлшері 33-49 мың ж.н.  бөліктен  ДНҚ фрагменттерін  көбейтуге болады.  Космидтер сыйымдылығы ең үлкен векторлар, сондықтан эукариоттық ДНҚ-ның  үлкен фрагменттерінің  көшірмелерін және  геномның гендер банкін(жинағын) клондардың барынша аз  санымен алу үшін арнайы құрастырылған.

Клондаушы космидті вектордың негізгі компоненттері:

- ДНҚ репликациясы және детерминанттың антибиотикке тұрақтылығы басталуы үшін плазмидалық бөлігі;

- ДНҚ фрагментін клондауға жарамды  бір немесе біршене рестриктазалармен гидролизденетін аймақтардың бірлік саны;

- Лямбда фагының ковалентті байланысқан жабысқақ ұштары бар ДНҚ фрагменті.

Космидті векторлар геномының библиотекасында лямбда фагтық векторларына негізделген гендік библиотекаларға қарағанда клон саны азырақ болады.

Қазіргі кезде прокариоттық және эукариоттық гендер библиотекасын құрастыруда қолданылатын космидалардың кең спектрі белгілі.

Фазмида. Фаг  ретінде де, плазмида ретінде де дамуға қабілетті фаг пен плазмиданың арасындағы гибридтер фазмида деп аталады. Мұндай векторда СоlЕ1 мен λ фагтың инициация нүктесі бар және олар бактериофаг сияқты лизистік, плазмидалар сияқты лизистік емес   дамуғақабілетті.

Фазмидалық векторлардың сыйымдылығын лямбда фаг негізіндегі векторлармен салыстыруға болады, ол космидтерден анағұрлым аз.

Сонымен жоғарыда баяндалған мәліметтерден ген инженериясының векторлар системасы   микроорганизмдердің және олардың генетикалық элементтерінің қасиеттеріне негізделгенін байқауға болады. Векторлық   молекулаларға қойылатын негізгі талаптардың бірі, оларда рестрикциялық нүктелер болуы керек екендігін де атап өттік. Кейбір векторларда рестрикциялық бөліктер артық   болуы мүмкін. Мұндай жағдайда, ондай бөліктерді векторлардан делеция (бір немесе бірнеше нуклеотидтерді ДНҚ-дан иондық сәулелер және т. б. әсерімен үзілуі)   көмегімен «алып» тастайды.

Керісінше, вектордың керекті бөлігіңде   эксперимент үшін аса қажет және рестриктаза үзе алатын   тізбектер жоқ болуы да мүмкін. Бұл үшін химиялық синтездеу арқылы рестриктаза тани алатын нуклеотидтер тізбегі бар қысқа синтетикалық олигонуклеотид алынады. Лигазаның көмегімен қысқа синтетикалық олигонуклеотид вектордың керекті бөлігіне жалғанады. Оларды   линкер — жалғаулық (ағыл. біріктіру сөзінен) деп атайды. Линкерде әр түрлі бірнеше рестриктазалар үшін тізбектер бар болса, оларды полилинкер деп атайды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

18.Генді боліп  алу әдістері. Олардың артықшылықтары  мен кемшіліктерін көрсетіңіз

1.Генді алудың үш әдісі  бар: табиғи генді тікелей бөлу (сирек мүмкіндік), химиялық және ферменттік   синтез. Табиғи   генетикалық  материалдан — ДНҚ-дан   арнайы ферменттердің (рестрикциялық эндонуклеазалардың) көмегімен қажет  ген «кесіліп» алынады. Бұл әдістің елеулі кемшіліктері бар. Біріншіден, ДНҚ-дан қажет генді танып, кесе алатын ферментті таңдап алу қиын.   Фермент тенді әрқашанда наңтьі шекарасыпда емес әр қилы үзеді: не геннің екі жағынан артық нуклеотидтерді үзуі,  не түгел үзбеуі мүмкің, мұндай ДНҚ фрагментерінің қызметі жеткіліксіз, сондықтан   оларды пайдалану мүмкін   болмайды. Екіншіден, эукариоттық организм геномының экзон-интрондық   құрылысы, олардың гендерін   бактерияларға енгізгенде функциялық тұрғыдан қиындық туғызады, өйткені бактериялық клеткада сплайсинг процесі (ин-трондардың кесілуі) өтпейді. Үшіншіден, егер ген барлық ДНҚ-ның аз ғана бөлігін құраса, онда оны бөлу мен анықтауда елеулі қиындықтар пайда болады. Сондықтан бұл әдіс негізінен генетикалық эксперименттер талабына сәйкес вирус пен бактериялардың генін бөлуде қолданылады.

2.Генді-синтездеудің  химиялық әдісі. Бұл әдістер   белоктың немесе полипептидтің бірінші құрылымы  ( амин қышқылдар қатары) белгілі болса, оның генінің  нуклеотидтер қатары химиялық жолмен синтезделеді.

Берілген   нуклеотидтер тізбегі бойынша   ДНҚ - синтездеу әдісін   1969 жылы, ген инженериясының   дәуірі басталмаған кезде-ақ, Г. Корана ұсынған болатын. Ашытқы  тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 н. ж. құралған. Алдымен, ұзындығы 5—12 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа фрагменттері синтезделді,   онан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) әсерімен бір-бірімен қосылды. Алайда, алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының клеткасына енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші элементтер — промотор және терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г. Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-ының генін синтездей алды. Геннің ұзындығы 126 н. ж. тең болды, оған 52 н. ж. құралған промотор, 21 н. ж.— терминатор және ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ және ТТАА) жалғанды. Нәтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы Е. Со1і клеткасына енгізгенде олар өз функциясын көрсете алды.

Қазіргі уақытта Г. Корана өңдеген әдістер бірқатар жасанды гендерді синтездеу үшін қолданылады. Осындай жолмен адамның — инсулин және интерферон, адам мен жануарлардың — энкефалин және бардикинин гормондарының функциялы гендері синтезделді.

Қазіргі кезде гендерді автоматты синтездейтін құралдар бар. 1980 ж. Итакура алғаш өзінің құрамында алдын ала берілген тізбек бойынша 6 сағ. ішінде 12-мүшелік олигонуклеотидті синтездеуге қабілетті автоматтың жұмысын компьютер бақылады. Мұндай жабдықтардың 1982 жылғы бағасы 36000—39500 долларға тең болатын. Егер 1979 жылы 120 н. ж. генді синтездеу үшін екі жыл керек болса, ал 1981 ж. бұл мақсатқа үш-аң күнде жетуге болады.