Шпаргалка по "Гендік инженерия"

Полинуклеотидкиназа ДНҚ молекуласының 5` соңын таңбалауға арналған. 32Р таңбалайды. Полинуклеотидкиназа ДНҚ молекуласының 5` соңын фосфорламаса, онда ДНҚ-лигаза өзінің жұмысын атқара алмайды (тіге алмайды).

Терминальды трансфераза 1962 жылы Боллум деген ғалым бұзаудың тимус безінен алған. Mg2+ ионы кофакторы, ал субстрат ретінде 3`-ОН соңы бар біртізбекті ДНҚ. ДНҚ-ның 3` соңына қосымша нуклеотидтерді қосуға көмектеседі.

Кофактор ретінде Mg2+ ионын пайдаланса, онда ДНҚ молекуласының бір тізбегіне немесе жабысқақ соңды қос тізбегіне қосымша нуклеотидтерді жалғайды.

Кофактор ретінде Со2+ ионын пайдаланса, ДНҚ молекуласының түзу соңды екі тізбегіне қосымша нуклеотидтерді жалғайды.

 Рестриктазалық эндонуклеаза- микроорганизмдерде кең таралған. Бактерияның бактериофагтарға төзімділігін арттырады. Белгілі бір сайттарды танып, таңбалап отырады. Дұрыс метилденбеген бактериофагтардың көбеюін шектейді. Қазір 1000-нан астамы табылған. Рестрикция сайтын-полиндром деп атайды. Полиндром 5` соңынан бастап санағанда басынан аяғына, аяғынан басына дейін оқығандабірдей оқылады. Таңдамалы аудан 4,6,8 жұп нуклеотидтерден тұрады. Осы таңбалы аудандармен байланысып, ДНҚ молекуласын үзеді.

Бактериальды штамм рестрикциялық активтілікпен қатар ДНҚ-ны метилдеу қабілеті бар. Метилаза метил тобын аденин мен цитозин қалдықтарына рестрикциялық ферментпен байланысқан сайтта жалғайды. Сонда метилденген сайт рестрикция ферментіне төзімді болады.

Рестриктазаның 3 түрі бар.

Рестриктаза I кесу ерекшеліктері байланысқан жерден алыс кеседі. 1000 нуклеотид қашықтықтан.

 Рестриктаза II ке6су ерекшелігі  таңдамалы ауданмен байланысқан  жерінен, соның шеңберінде кеседі.

Рестриктаза III кесу ерекшелігі таңдамалы ауданның 17-20 нуклеотид қашықтықта кеседі.

Рестриктаза I және III екі  активтілігі бар. Метилдеуші; АТФ- эндонуклеаза. АТФ-қа тәуелді болады. Ал, Рестриктаза II гендік инженерияда көп пайдаланылады. Себебі, екі блоктан тұрады: рестрикциялық эндонуклеаза мен метилаза. Оларға кофактор ретінде Mg2+ ионы қажет. Қазір 500-ге жуық түрі бар.

Кері транскриптаза мРНҚ-дан ДНҚ-ның комплементарлы тізбегіне транскипциялануында пайдаланылады. Яғни, мРНҚ-дан ДНҚ-ны синтездейді.

Сілтілі фосфотаза ферменті ДНҚ молекуласының 5` соңындағы фосфорды жояды. Себебі, бөгде ДНҚ-ның плазмидаға ену эффективтігін арттырады.

Поли-(А)-полимераза 1973 жылы Сиппел деген ғалым синтездеп алған. Ол 3` соңындағы РНҚ поли(А)молекуласының бір тізбекте жалғасуын катализдейді. мРНҚ 3` соңына поли-адениннің қосылуын қамтамасыз етеді.

 

6. Рестрикциялық эндонуклеазалар.  Олардың классификациясы.

Рестрикциялық эндонуклеазалар (лат. Restrictio –тежеу) – нуклеин қышқыддарының гидролиз реакциясын катализдейтін гидролазалар тобына жататын ферменттер тобы. й

Экзонуклеазалардан айырмашылығы  рестриктазалар нуклеин қышқылдарын соңынан емес  ортасынан үзеді.  Әр рестриктаза ДНҚ ның белгілі бір бөлігін танып сол сол бөліктің нуклеотидтер тізбегін үзеді.

 Бактериалдық геномның  өз рестриктазасынан қорғанышы  аденин және цитозин қалдықтарының  метилденуі арқылы жүзеге асады.

Классификация

Танитын сайттары симметриялық (палиндромды) және симметриялық емес болатын Рестрикция ферменттерінің негізгі 3 типі бар: 

- Бірінші тип рестриктазалары (мысалы, ЕсоК из Escherichia coli К12) белгілі бір нуклеотидтер тізбегін танып,  осы тізбектің маңындағы қос тізбекті ДНҚ молекуласын кез келген нүктеден  үзеді, және үзу нүктесі қатаң түрде белгілі бір нүкте емес. (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удалённой областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК).

- Екінші тип рестриктазалары (мысалы, EcoRI)  белгілі бір тізбекті танып,  қос тізбекті ДНҚ ны  осы тізбектің ішінде белгілі бір бекітілген нүктеден үзеді. Бұл тип рестриктазалары  орталық осінен екі бағытта да симметриялы палиндромды тізбектерді таниды.

- Үшінші аралық тип рестриктазалары (мысалы, EcoPI) керекті тізбекті танып, қос тізбекті ДНҚ ны сол тізбектің соңынан кейінгі  нуклеотидтер жұбының белгілі бір санынан кейін(немесе тану сайтынан әртүрлі қашықтықта бірнеше нүктеден) үзеді.

Нәтижесінде ) 5' немесе 3'- жабысқақ не түзу соңды  ДНҚ фрагменттері пайда болады. Бұл рестриктазалар ассиметриялық сайттарды таниды.

Изошизомерлер —  бірдей  тізбектерді танитын  рестрикциялық эндонуклеазалар жұбы. Кейде метилденген нуклеотидтер қалдықтарының  болуымен ерекшеленеді. Мысалы Sph I (CGTAC^G) және  Bbu I (CGTAC^G).

Тану мен спецификалық үзу үшін рекшеленген алғашқы фрагмент прототип деп аталады, ал қалған рестриктазалар изошизомерлер деп аталады. Оларды әр түрлі бактерия штаммдарынан бөліп алады, сол себепті изошизомерлер әр түрлі реакция жағдайларын талап етеді.

Дәл осындай тізбектерді танитын бірақ оларды өзгеше үзетін ферменттерді гетерошизомерлер деп атайды. Мысалы: Sma I (GGG^CCC) және Xma I (G^GGCCC) рестриктазалары.

1 ші және 3 ші тип ферменттері  күрделі суббірліктік құрылымға  ие, және екі тип белсенділігі  бар. – модификациялаушы(метилдеуші) және АТФ тәуелді эндонуклеазалық.

2ші тип ферменттері  екі бөлек белоктан тұрады: рестрикциялық  эндонуклеаза және модификациялайтын  метилазалық,сол себепті гендік инженерияда тек 2ші тип ферменттері пайдаланылады. Оларға кофактор ретінде магний иондары қажет.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10. Рекомбинантты  ДНҚ молекуласын құрастыруда  қолданылатын ферменттер. Рестрикциялаушы  эндонуклеаза және ДНҚ лигаза  ферменттері.  Олардың классификациясы  және қасиеттерін көрсетіңіз.

Рестриктазалық эндонуклеаза- микроорганизмдерде кең таралған. Бактерияның бактериофагтарға төзімділігін арттырады. Белгілі бір сайттарды танып, таңбалап отырады. Дұрыс метилденбеген бактериофагтардың көбеюін шектейді. Қазір 1000-нан астамы табылған. Рестрикция сайтын-полиндром деп атайды. Полиндром 5` соңынан бастап санағанда басынан аяғына, аяғынан басына дейін оқығандабірдей оқылады. Таңдамалы аудан 4,6,8 жұп нуклеотидтерден тұрады. Осы таңбалы аудандармен байланысып, ДНҚ молекуласын үзеді.

Бактериальды штамм рестрикциялық активтілікпен қатар ДНҚ-ны метилдеу қабілеті бар. Метилаза метил тобын аденин мен цитозин қалдықтарына рестрикциялық ферментпен байланысқан сайтта жалғайды. Сонда метилденген сайт рестрикция ферментіне төзімді болады.

Рестриктазаның 3 түрі бар.

Рестриктаза I кесу ерекшеліктері байланысқан жерден алыс кеседі. 1000 нуклеотид қашықтықтан.

 Рестриктаза II ке6су ерекшелігі  таңдамалы ауданмен байланысқан  жерінен, соның шеңберінде кеседі.

Рестриктаза III кесу ерекшелігі таңдамалы ауданның 17-20 нуклеотид қашықтықта кеседі.

Рестриктаза I және III екі  активтілігі бар. Метилдеуші; АТФ- эндонуклеаза. АТФ-қа тәуелді болады. Ал, Рестриктаза II гендік инженерияда көп пайдаланылады. Себебі, екі блоктан тұрады: рестрикциялық эндонуклеаза мен метилаза. Оларға кофактор ретінде Mg2+ ионы қажет. Қазір 500-ге жуық түрі бар.

ДНҚ-лигаза 1967 жылы Мезельсон тапты. Ол ДНҚ фрагменттерін тігеді. Фосфодиэфирлі нуклеин қышқылдарының қостізбекті молекуласындағы байланыстың синтезін катализдейді. Лигазалар ДНҚ репарациясы мен  репликациясына қажет. Гендік инженерияда ДНҚ-лигазаның екі түрі қолданылады. Оларды кофакторы және қызметіне қарай ажыратылады. Кофактор ретінде НАДН пайдаланылады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

11. ДНҚ және  РНҚ матрицасында ДНҚ молекуласының  синтезделуін катализдейтін ферменттер. Олардың құрылыс ерекшеліктері  мен қасиеттерін көрсетіңіз

Кері транскриптаза мРНҚ-дан ДНҚ-ның комплементарлы тізбегіне транскипциялануында пайдаланылады. Яғни, мРНҚ-дан ДНҚ-ны синтездейді.

Кері транскрип-за екі суббірліктен тұрады.албфа ж/е бетта.

Ферменттің үш түрлі активтілігі бар:

1-РНҚ және ДНҚ –ні матрица есебінде  пайда-н ДНҚ-полимеразалық актив-лік.

2-РНҚ-ні гидролиздейтін рибонуклеаза Н актив-лік.

3-ДНҚ –эндонукле-дық автив-к.

кДНК-ның бірінші тізбегінің синтезі:

гетерогенді мРНК популяцияларымен жұмыс жасаған кезде келесі жағдайларды қолданады:

- Кері транскриптаза

- рН 8,3

- Бірвалетті катиондар  (калий иондарын пайдаланған кезде , натрий иондарын пайдаланғанмен салыстырғанда ұзынырақ транскриптер алуға болады) және еківалентті катиондар( еківалентті катиондар кері транскриптазаның белсенділігін қамтамасыз ету үшін қажет,)

-Дезоксирибонуклеозидүшфосфаттар  (кДНК-ның эфективті синтезі үшін  әр Дезоксирибонуклеозидүшфосфаттардың жоғары концентрацияларын қолдану маңызды. Егер олардың біреуінің концентрациясы 10-50мкм –ден төмен түссе толық өлшемді транскриптер саны азаяды.)

кДНК ның екінші тізбегінің синтезі

Бір тізбекті   кДНК ның  3' ұшында  кДНК ның екінші тізбегінің синтезі кезінде  E.coli  дің ДНК-полимеразасының немесе  кері транскриптазаның көмегімен затравка ретінде пайдалануға болатын ілмек тәрізді структуралар пайда болуы мүмкін.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12. ДНҚ фрагменттерінің  соңдарын модификациялаушы  ферменттер: терминальді трансфераза, полинуклеотид  киназа, сілтілі фосфатаза, поли  А-полимераза және олардың гендік  инженерияда қолданылу аясын  көрсетіңіз.

Полинуклеотидкиназа ДНҚ молекуласының 5` соңын таңбалауға арналған. 32Р таңбалайды. Полинуклеотидкиназа ДНҚ молекуласының 5` соңын фосфорламаса, онда ДНҚ-лигаза өзінің жұмысын атқара алмайды (тіге алмайды).

Терминальды трансфераза 1962 жылы Боллум деген ғалым бұзаудың тимус безінен алған. Mg2+ ионы кофакторы, ал субстрат ретінде 3`-ОН соңы бар біртізбекті ДНҚ. ДНҚ-ның 3` соңына қосымша нуклеотидтерді қосуға көмектеседі.

Кофактор ретінде Mg2+ ионын пайдаланса, онда ДНҚ молекуласының бір тізбегіне немесе жабысқақ соңды қос тізбегіне қосымша нуклеотидтерді жалғайды.

Кофактор ретінде Со2+ ионын пайдаланса, ДНҚ молекуласының түзу соңды екі тізбегіне қосымша нуклеотидтерді жалғайды.

Сілтілі фосфотаза ферменті ДНҚ молекуласының 5` соңындағы фосфорды жояды. Себебі, бөгде ДНҚ-ның плазмидаға ену эффективтігін арттырады.

Поли-(А)-полимераза 1973 жылы Сиппел деген ғалым синтездеп алған. Ол 3` соңындағы РНҚ поли(А)молекуласының бір тізбекте жалғасуын катализдейді. мРНҚ 3` соңына поли-адениннің қосылуын қамтамасыз етеді.

13. ДНҚ тізбегін  анықтаудың химиялық әдісі (Максам-Гильберт) мен ферментативтік әдістің (Сэнгер әдісі) сипаттамасы мен ерекшеліктерін көрсетіңіз

Қазіргі кезде ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтау үшін екі әдіс — Максам-Гилберт және Сэнгер-кең қолданылады. Екі әдістің де мәні мөлшері бойынша бір негізге айырмашылығы бар жалғыз тізбекті ДНҚ молекуласын алудан тұрады. Мұндай молекулаларды электрофорез көмегімен акриламид гелінде бөлуге болады. Мөлшері әр түрлі белдеулер ұзындығы 300 нуклеотидке дейін жететін «саты» түзейді.

Бірінші әдісті АҚШ ғалымдары У. Гилберт пен оның шәкірті           Л. Максам ұсынды. Мұнда қостізбекті ДНҚ үзіндісінің 5'— ұштарын радиоактивті фосформен белгілейді. Мұны ішек таяқшасын зақымдайтын, Т4 бактериофагынан бөлінген полинуклеотидкиназа іске асырады. Бұл фермент АТФ молекуласынан фосфат тобын ажыратып, полинуклеотидтің 5'— ұшына жалғайды. Бұдан кейін қос тізбекті ДНҚ-ны денатурациялап, ДНҚ-ның жеке тізбектерін гелде электрофорез арқылы айырады. Мұнан соң тізбектің әрқайсысын гелден жеке жуып алып, бөлек зерттейді. Ары қарай, үлгілерді төрт бөлікке бөледі. Біріншісіне ДНҚ-ны кез келген аденинді нуклеотидінен кейін үзетін ерітінді қосады. Оны ДНҚ тізбегінің бір аденин бөлігін  ғана үзетіндей етіп қосу керек. Нәтижесінде тізбекте адениннің әр қилы орналасуына байланысты ұзындығы әр түрлі ДНҚ үзінділері пайда болады.

Дәл осындай жолмен басқа үш бөлікті де ДНҚ-ны тиминнен, гуаниннен және цитозиннен  кейін үзетін реагенттермен өңдейді.  Барлық төрт үлгідегі ДНҚ үзінділері бір-біріне параллель орналасып, полиакриламид гелінде электрофорез арқылы айырады: молекуласы аз кесінділер жоғары молекулалы  кесінділерге карағанда гельде жылдам қозғалады.Мұнда қолданылатып электрофорез әдісі жақсы жетілген,  ол барлық    ДНҚ фрагментерін ұзындығы   бойынша жеке бөліктерге айыруға мүмкіндік береді. Қазіргі кезде ұзындығы 300-ге дейін ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер катарын анықтаудың ешқандай қиындығы жоқ.

Геннің нуклеотидтер қатарын оқу үшін қараңғыда гелдің үстіне рентген фотопленкасын беттестіреді, мұнда радаоактивті таңба бар орындар ғана таңбаланады.   Фотопленкада 5/ - ұштары белгіленген ДНҚ кесінділері ғана көрінеді, ал олардың гелдің басынан жылжыған ара қашықтығы кесіндінің ұзындығына дәлме-дәл келеді. Енді ДНҚ тізбегін төменнен жоғары қарай оқып, геннің нуклеотидтік қатарын анықтауға болады.

Зерттеуші екінші комплементарды ДНҚ үзіндісінің нуклеотидтер қатарын анықтап, бірінші тізбектен алынған мәлімет дұрыстығын тексере алады. Мұнда тек, бірінші тізбектегі аденин мен цитозиннің орнына екінші тізбекте тимин мен гуаниннің сәйкес келетінін естен шығармау керек.

ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтаудың Сэнгер әдісі

1.ДНҚ-ның нуклеотидтер  қатарын анықтаудың екінші тәсілін  Нобель сыйлығының екі дүркін  лауреаты атанған ағылшынның  атақты ғалымы Ф. Сэнгер ұсынды. Сэнгер әдісінің көп жақтары  Максам-Гильберт әдісімен ұқсас  болғанымен оның принципінің  айырмашылығы бар — Сэнгер бойынша нуклеотидтер қатарын анықтау ДНҚ-полимераза яғни ДНҚ-ны ажырататын емес, керісінше оны синтездейтін фермент көмегімен іске асады. Мұнда ген үзіндісінің өзі емес, ДНҚ-полимеразаның көмегімен синтезделетін ДНҚ молекуласы зерттеледі. Ферменттің әсерімен ұзындығы әр түрлі ДНҚ молекулалары синтезделеді, олардың 5'— ұштары бірдей, ал 3'— ұштары төрт азоттық негіздің (А, Т, Г немесе Ц) бірі бойынша әр түрлі.

Сэнгер әдісінде нуклеотидтер қатары белгісіз ДНҚ сегментін М1З бактериофагының ДНҚ-сынан құрастырылған арнайы векторға енгізеді. Біз бұл фагтың векторлық молекула ретінде ыңғайлы айырмашылығын жоғарыда қарадық, атап айтқанда генді жалғыз тізбекті күйде тасымалдай алады. Мұндай тізбектің нуклеотидтер қатарын анықтау оңай. М1З бактериофагының ДНҚ-сы қос тізбекті күйде де бола алады. Осындай фагтың негізінде бірнеше векторлар құрастырылды. Фагтың репликациясы үшін оның геномының маңызды емес аймағына шамамен ондаған әр түрлі рестриктазалар үзе алатын полилинкер жалғанады. Полилинкердің қатарына 17 н. ж. құралған тізбек жалғанады. Осындай векторды рестриктазалардың бірімен үзгеннен кейін оны талдауға алынған және сол рестриктазамен үзілген ДНҚ бөлігімен біріктіреді. Мұнда ол вектордың 17 мүшелік тізбегімен қатар орналасады. Міне осындай рекомбинантты ДНҚ-ны бактерия клеткасына енгізіп, одан жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар фагтарды алады. Енді фагтан ДНҚ-ны айырьш, оны талдауға кірісуге болады.