Флуометрический анализ

3. Нелинейная флуориметрия сложных органических веществ

Сложные органические соединения играют большую роль в природе, широко используются в самых различных технологиях. Поэтому разработка методов и средств их обнаружения, измерения концентрации и определения состояния (то есть методов диагностики) была и остается актуальной научной и технической проблемой. Особый интерес представляют сложные органические соединения, которые входят в состав природных сред и живых организмов или которые попадают в эти объекты, а иногда специально вводятся в них с теми или иными целями. [21]

Очевидно, что наиболее ценными являются такие методы и средства, которые обеспечивают диагностику без разрушения объекта (то есть in vivo), непосредственно в среде обитания сложного органического соединения (то есть in situ), с высокой чувствительностью, экспрессно, а в ряде случаев (например, в системах экологического мониторинга) дистанционно.

Природа преподнесла нам подарок: многие органические соединения обладают способностью флуоресцировать при оптическом возбуждении с квантовым выходом, достаточным для решения диагностических задач. Все они обладают полосами флуоресценции, положение, форма и интенсивность которых могут быть использованы для диагностики указанных соединений. [34]

Флуориметрия как метод спектрального анализа и диагностики сложных органических соединений обладает достоинствами, делающими ее чрезвычайно привлекательной. Во-первых, полоса флуоресценции смещена (и иногда весьма значительно) в длинноволновую область спектра относительно полосы поглощения, что позволяет при регистрации флуоресценции отстраиваться от фона, создаваемого упругим рассеянием фотонов на неоднородностях среды (рассеянием Рэлея и Ми), и эффективно подавлять этот фон. Во-вторых, сечение флуоресценции для хорошо флуоресцирующих соединений настолько велико, что позволяет регистрировать флуоресценцию сред с чрезвычайно низкой концентрацией флуоресцирующих молекул. [15]

Замена обычных источников возбуждающего излучения на лазеры значительно улучшает характеристики флуоресцентного анализа в классическом варианте (в частности, еще больше поднимает чувствительность). Но главная, принципиально новая возможность, которая открывается с применением лазеров во флуориметрии, связана с насыщением флуоресценции - нелинейной зависимостью числа фотонов флуоресценции от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. На этом основана нелинейная флуориметрия. Но прежде чем перейти к изложению физических основ этого нового метода спектроскопии, посмотрим, так ли велика необходимость в этом методе. А для этого укажем на трудности (и подчас весьма серьезные), с которыми сталкивается классическая (линейная) флуориметрия. Для разных объектов в различных задачах диагностики эти трудности проявляются по-разному. Для определенности рассмотрим, какие препятствия возникают на пути решения задач диагностики природных органических комплексов (ПОК) в водных средах. Первое препятствие - большая ширина полос флуоресценции ПОК и перекрытие полос разных ПОК, одновременно присутствующих в природных водах. Определяющий вклад в спектр флуоресценции этих сред дают четыре класса ПОК: фотосинтезирующие организмы - фитопланктон, водное гумусовое вещество, аминокислоты в свободном состоянии или в составе белковых соединений, нефти в виде пленки на поверхности, эмульсии и в растворенной форме в объеме воды. [13, 27]

Второе препятствие - идентичность или близость полос флуоресценции представителей одного класса ПОК.

Третье препятствие. Изменение состояния ПОК, как правило, практически не отражается на форме и положении полос флуоресценции, но влияет на ее интенсивность. Это затрудняет определение концентрации ПОК по интенсивности флуоресценции и не дает возможности проводить диагностику состояния ПОК (например, фотосинтетической активности водорослей). [31]

Преодолеть указанные препятствия и решить в полной мере проблему диагностики ПОК невозможно в рамках только феноменологического подхода, то есть оперируя лишь спектрами излучения и возбуждения флуоресценции, хотя, конечно, эти спектры дают большой объем информации. Необходимо выходить на молекулярный уровень и в дополнение к спектрам использовать молекулярные фотофизические параметры: сечения поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. При этом указанные параметры необходимо измерять in vivo и in situ, причем в условиях дефицита информации о локальных концентрациях молекул в ПОК. [14]

В настоящее время единственный способ измерения указанных параметров - нелинейная флуориметрия (флуориметрия насыщения). Важно подчеркнуть, что на этом пути решаются не только прикладные задачи диагностики ПОК, но и фундаментальные проблемы: установление механизмов

Причин для этого может буть несколько более физически понятная состоит в следующем. Если плотность потока фотонов F столь велика, что среднее время между их попаданиями в площадку, численно равную сечению поглощения молекулы oabs, меньше времени жизни молекулы в возбужденном состоянии, то молекула не успевает вернуться в основное состояние к моменту попадания в нее следующего фотона и этот фотон пролетает мимо молекулы - мы (при величине квантового выхода флуоресценции л = 1) лишаемся одного фотона флуоресценции (если слой среды оптически тонкий, то есть оabs ln0 < 1, где l - толщина слоя, n0 - концентрация молекул). Это явление обеднения основного состояния приводит к просветлению слоя среды и нелинейной зависимости Na (F) - к насыщению флуоресценции. Есть и другие механизмы насыщения флуоресценции, на Очевидно, что параметры кривой насыщения Nfl (F) определяются фотофизическими характеристиками молекулы и, следовательно, эти характеристики могут быть определены по параметрам кривой насыщения. Решение такой обратной задачи и составляет существо нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) как метода спектрального анализа любых флуоресцирующих атомов и молекул. Особенно актуален этот метод применительно к сложным органическим соединениям и комплексам. [26]

Какой бы алгоритм решения обратной задачи ни использовался, мы должны располагать теоретической (расчетной) кривой насыщения флуоресценции, которая может быть получена путем решения системы кинетических (скоростных) уравнений для населенностей энергетических состояний флуоресцирующих молекул. [28]

Узловым моментом этой процедуры является рациональный выбор физической модели, описывающей взаимодействие оптического излучения с ансамблем флуоресцирующих органических молекул или комплексов. В математической формулировке это определяет число параметров, подлежащих определению при решении обратной задачи. [17]

Для сложных органических молекул в случае, когда можно пренебречь взаимодействием между ними, приоритетными параметрами, влияющими на кривую насыщения, являются:

а) сечение поглощения оabs = о13, определяющее вероятность перехода молекулы из основного синглетного состояния S0 (c уровня 1) в первое возбужденное синглетное состояние S1 (уровень 3) под действием потока фотонов с плотностью F (см"2 с"1);

б) время жизни х3 молекулы в состоянии S1, то есть на уровне 3;

в) квантовый выход молекул в нижнее триплетное состояние T1 (на уровень 2) в результате перехода S1 - T1, называемого интеркомбинационной конверсией: лT = k32/k3, где k3 = k31 + k'31 + k32; k31 и k’31 - скорости излучательных и безызлучательных переходов из S1 в S0; k32 - скорость перехода S1 - > T1.

Параметр kj (его размерность с"1) характеризует вероятность перехода с уровня на уровень j таким образом, что если n - концентрация молекул в исходном состоянии то kipi - число молекул (в единице объема), перешедших за 1 секунду из состояния в состояние j. В рассматриваемой модели имеются три канала дезактивации уровня S1, которые характеризуются параметрами k31, k31 и k32. Поэтому полное число молекул (в единице объема), покидающих уровень S1 в 1 секунду, равно k3n3 и, следовательно, х3 = k-1 - время жизни этого уровня.

Число фотонов флуоресценции, испущенных элементом объема dV= dx*dy*dz в интервале времени от t до t + dt. [19]

4. Обратные задачи флуориметрии насыщения

Зная характеристики кривой насыщения, можно в принципе определить фотофизические параметры молекулы или комплекса. Задачи такого рода называются обратными. В общем случае они являются некорректными.

Однако, используя априорную информацию о фотофизических процессах, формирующих флуоресценцию сложных органических соединений и комплексов, можно ограничить число параметров модели и пределы их изменения так, чтобы задача стала корректной по А.Н. Тихонову, то есть удовлетворяла трем условиям: решение существует, решение единственно и устойчиво. В нашей задаче устойчивость гарантирована ограниченностью числа восстанавливаемых параметров: в рассмотренных к настоящему времени обратных задачах нелинейной флуориметрии число определяемых параметров варьировали от одного до трех и в будущем оно едва ли превысит пять. [3]

Что касается единственности решения, то она доказана для трехпараметрической модели, описываемой системой кинетических уравнений с определяемыми параметрами. Таким образом, эта обратная задача является корректной по А.Н. Тихонову. Есть все основания полагать, что добавление четвертого параметра - константы скорости синглет-синглетной аннигиляции g не приведет к утрате этого свойства, хотя здесь требуется отдельное доказательство. [24]

Теоретически устойчивая обратная задача может стать неустойчивой на практике.

Причинами практической неустойчивости являются погрешности (шумы) входных данных и отклонение реальных процессов от модели, по которой рассчитывают теоретические зависимости (в нашем случае кривые насыщения). Практическая неустойчивость возникает, когда шумы входных данных или отклонение процессов от модели превышают некоторые допустимые величины. Пороги возникновения практической неустойчивости зависят как от характера фотофизических процессов в объекте, так и от свойств алгоритма решения обратной задачи. В общем случае кривые насыщения флуоресценции - исключительно неблагоприятный класс входных данных для обратных задач. Это монотонные кривые без каких-либо резких элементов, за которые можно было бы "зацепиться". Для одного типа объектов кривые насыщения по форме мало отличаются друг от друга. [11]

Это приводит к тому, что практическая неустойчивость возникает уже при весьма низком уровне погрешностей входных данных: для двухпараметрической задачи это единицы процентов, для трехпараметрической менее процента, что трудно обеспечить в эксперименте. Однако это имеет место при использовании наиболее распространенного метода решения обратных задач - метода наименьших квадратов (МНК). В его основе лежит процедура минимизации функционала невязки между экспериментальными и теоретическими данными путем вариации искомых параметров в ограниченном объеме их возможных значений. Если экспериментальная кривая неидеальна (снята с большими погрешностями или не соответствует теоретической модели), одного интегрального параметра (невязки) оказывается недостаточно, чтобы найти наилучшую аппроксимирующую кривую, рассчитанную для значений параметров модели в допустимой (из физических соображений) области их значений. [20]

Некоторое время ситуация казалась тупиковой, и метод нелинейной флуориметрии мог умереть, не успев родиться. На помощь пришла современная компьютерная техника искусственных нейронных сетей (ИНС).

Уникальным свойством нейросетей является их способность обучаться на примерах и не просто запоминать, а обобщать представленную информацию, выявлять скрытые закономерности и классифицировать предъявляемые данные. В ИНС для операции с экспериментальными данными создается сеть нейронов, каждый из которых имеет некоторое количество входов и один выход. Математически нейрон можно описать как взвешенный сумматор:

y = т (2, wixt),

где y - значение выходной величины, T - передаточная функция (обычно нелинейная), xi - значения входных величин, w: - веса связей. ИНС состоит из нескольких слоев нейронов. Входной слой имеет количество нейронов, равное количеству элементов в наборе входных данных, в нашем случае количеству точек на кривой насыщения. Выходной слой должен иметь число нейронов, совпадающее с числом определяемых параметров. На первом этапе работы сети происходит ее обучение на известных данных с целью получения наилучшей матрицы весов w. [16]

Процесс обучения часто занимает продолжительное время, зато хорошо обученная сеть быстро и с высокой точностью выдает значения искомых параметров при предъявлении ей набора экспериментальных данных.

Применительно к нашей обратной задаче принципиальное отличие техники ИНС от традиционного метода наименьших квадратов состоит в том, что ИНС узнает кривую насыщения не по одному интегральному параметру (невязке), а по большому числу признаков. Набор этих признаков формируется в процессе тренировки сети и является ее секретом. Как показали модельные расчеты (численные компьютерные эксперименты), алгоритмы решения обратных задач, основанные на технике ИНС, уже сейчас обеспечивают вполне приемлемую практическую устойчивость решения, а ведь возможности ИНС в этой области далеко не исчерпаны. [25, 32]

5. Приборы для проведения флуориметрического метода в фармацевтическом анализе

Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции, можно разделить на три категории: – флуориметры, флуоресцентные приставки к спектрофотометрам и спектрофлуориметры.

Каждый такой прибор включает в себя шесть основных узлов:

 – источник возбуждающего  света;

 – селектор частоты возбуждающего  света и частоты люминесценции;

 – кюветное отделение, предназначенное  для размещения кюветы с измеряемым образцом (стандартным образцом или пробой);

 – фотоприемник люминесценции (фотоэлемент, фотоумножитель, фотодиод);

 – усилитель сигнала;

 – миллиамперметр.

Во флуориметрах селекция частот возбуждающего света и света флуоресценции осуществляется с помощью светофильтров. Флуориметры применяют для проведения серийных анализов, где снижение селективности не является большим недостатком, а высокая чувствительность, напротив, представляет собой важное достоинство. [22]

При измерении флуоресценции с помощью флуориметров существенное значение имеет правильный выбор светофильтров, возбуждающего флуоресценцию (первичный светофильтр), и света флуоресценции (вторичный светофильтр). Первичный светофильтр должен пропускать свет в области поглощения определяемого вещества и не должен пропускать свет в области, отвечающей флуоресценции вещества. Вторичный светофильтр должен пропускать флуоресценцию, но возбуждающий свет должен им полностью поглощаться. Источниками возбуждающего света во флуориметрах обычно служат ртутные лампы низкого давления. С целью получения практически сплошного спектра излучения внутренние стенки этих ламп часто покрывают люминофором. [12, 34]