Биохимия мочи

Проба Нилеидера.

Принцип. Проба основана на відновленні глюкозою нитрату вісмуту в металічний вісмут.

Приготування  реактиву. 2г нітрату вісмуту розтирають в ступці з 4г сегнетової солі, розчиняють в 10мл 10% розчину їдкого натру і фільтрують. Реактив безколірний. Зберігають в пляшці з темного скла.

Хід реакції. До сечі додають реактив у співвідношенні 2:1 і кип’ятять 3хв. В присутності глюкози зявляється забарвлення від коричневого до чорного, при стоянні утворюється темний осад. Ця проба частіше ніж інші видає позитивний результат за відсутності глюкози в сечі. Позитивний результат отримується в присутності інших редуцируючих речовин, що знаходяться в сечі (білок, лікарські речовини: антипірин, саліцилова кислота, антибіотики – біоміцин, тетрациклін).

КІЛЬКІСНІ ПРОБИ

 

Поляриметричний метод.

 

Принцип. Використання властивості глюкози обертати площину поляризації вправо. По куту обернення поляризованого променю можна визначити кількість глюкози в сечі.

Хід реакції. Сеча повинна бути прозорою, кислої реакції, звільнена від білку. Сечу підкисляють слабкою оцтовою кислотою, кип’ятять , охолоджують і фільтрують. Якщо сеча містить багато пігментів або мутна, використовують адсорбенти (ацетат свинцю, інфузорна земля, тваринне вугілля та ін.) в колбу емністтю 50мл насипають адсорбент, наливають сечу, перемішують і фільтрують.

Трубку поляриметра заповнюють профільтрованою сечею (без бульбашок  повітря), накривають шліфованим скельцем, закручують щільно, насухо витирають  і ставлять в апарат. При зміненні кольору або інтенсивності освітлення частини поля зору обертанням диску зрівнюють поля і визначають кут відхилення поляризованого променя, що виражається в градусах шкали приладу. При довжині трубки 18,94 см кут відхилення в 1^оС відповідає 1% глюкози; при довжині 9, 47см, то отримані результати множать на 2, якщо довжина 4,73см, то множать на 4.

Користуючись цим методом  необхідно дотримуватись таких  умов:

1. Після заповнення трубки визначення проводять через 2-3хв, так як коливання частинок рідини заважає дослідженню.
2. Не варто залишати на довгий час заповнену сечею трубку, так як при цьому утворюється помутніння.
3. Після закінчення роботи трубку і скельця промивають дистильованою водою і висушують. Проточною водою промивати не можна, так як на скельцях утворюється мутний наліт.

Колориметричний метод Альтгаузена.

Принцип. Використовується кольорова реакція, що отримується від нагрівання розчину глюкози з лугом.

 

Хід реакції. До 4мл сечі приливають 1мл 10% їдкого натру. Кип’ятять 1хв. Через 10хв після кип’ятіння колір рідини зрівнюють з кольоровою шкалою. На шкалі відповідно до кожної пофарбованої смужки позначено відсотковий вміст глюкози. Краще приготувати кольорову шкалу в пробірках (стандарти). Готують наступні розчини глюкози: 0,5; 1; 1,5; 2; 3 и 4% і обробляють їх так само як досліджувану сечу. Пробірки закривають пробками. Таким стандартом можна користуватись 7-10 днів, що зручніше, ніж паперова шкала.

Метод Альтгаузена простий і зручний в практичній роботі і може бути рекомендований в тих випадках коли немає поляриметра і для швидкого визначення глюкози в умовах клініки.

Визначення кількості  глюкози по Альтгаузену проводиться тільки після того як отримана позитивна якісна реакція на глюкозу.

2.3.3 Визначення кетонових (ацетонових) тіл

 

До кетонових тіл відносять  ацетон, ацетооцтову і β-оксімасляну кислоти.

 

Принцип. Якісні реакції на кетонові тіла основані на їх взаємодії з нітропрусидом натрію в лужному середовищі і появи кольорової реакції (утворення комплексних сполук червоно-коричневого кольору).

 

Проба Ланге.

 

Хід реакції. До 12-15мл сечі приливають близько 1мл 80% оцтової кислоти і близько -,5 мл 10% розчину нітропрусиду Натрію. Після того нашаровують аміак. В позитивному випадку на межі двох рідин утворюється фіолетове кільце. Воно може зявитися не одразу, а протягом 2-3хв.

Проба Легаля.

 

Хід реакції. До 5-6мл сечі додають декілька крапель свіжо приготованого 5% водноо розчину нітропрусиду натрію і 0,5мл 10-15% розчину їдкого натру. Отримуємо червоне забарвлення. Додають 0,5-1мл льодяної оцтової кислоти. Якщо червоний колір зникає, то роба негативна, якщо ж зберігається- позитивна. Якщо виходить слабко-рожеве забарвлення, то пробо вважається позитивною.

 

2.3.4 Визначення білірубіну

 

Принцип. В основі більшості якісних проб на білірубін лежить перетворення його в зелений білівердин під дією окисників (йод, азотиста кислота, три хлороцтова кислота та ін.)

 

Проба Розіна.

 

Хід реакції. На 4-5мл сечі нашаровують розчин Люголя, або 1% спиртовий розчин йоду. При позитивній реакції на межі між рідинами зявляється зелене кільце.

 

Проба Фуше.

 

Хід реакції. До 10-12мл сечі додають половину об’єму 15% розчину хлориду барію, змішують і фільтрують. Хлорид барію осаджує білірубін. На вийнятий фільтр наносять 2-3 краплі реактиву Фуше ( 100мл 25% розчину три хлороцтової кислоти і 10мл 10% розчину хлорного заліза). При позитивній реакції на фільтрі з’являються зелено-сині або блакитні плями.

 

 

 

2.3.5 Визначення уробіліногену

 

Проба Нейбауера.

 

Принцип. Проба основана на реакції між уробіліногеном і реактивом Ерліха, при якому утворюються червоного кольору конденсаційні сполуки.

 

Хід реакції. До декількох мілілітрів свіжої сечі додають декілька крапель (1 крапля на 1 мл сечі) реактиву Ерліха ( 2г парадиметиламінобензальдегіда і 100мл 20% розчину соляної кислоти). Пробу проводять при кімнатній температурі. При забарвленні рідини в червоний колір в перші 30с проба позитивна і означає збільшення кількості уробіліногену, забарвлення після 30с – нормальна кількість уробіліногену. Відсутність червоного забарвлення після стояння проби свідчить про нормальну кількість або відсутність уробіліногену. В не свіжій сечі реакція може дати негативний результат так як уробіліноген перетворюється в уробілін.

 

Проба Шлезингера.

 

Принцип. Поява при наявності уробіліну зеленої флюоресценції від утворених при додаванні ацетату цинку цинкуробілінових комплексів.

 

Хід реакції. До 4-5мл сечі приливають рівну кількість насиченого спиртового розчину ацетату цинку і 1 краплю розчину Люголя. Залишають на 10 хвилин. Після фільтрують. Пробірку оглядають на темному фоні в відображеному світлі. За наявності уробіліну утворюється зелена флюоресценція.

 

 

 

 

2.4 Експрес методи  біохімічного дослідження сечі

Для отримання швидких  результатів біохімічного аналізу  сечі можна використовувати тест смужки та автоматичні біохімічні експрес-аналізатори  сечі.

Принцип роботи останнього: Автоматичний аналізатор сечі має вбудовані рефрактометр (для визначення питомої ваги), Мутномір (Мутність) і колориметр (Колір сечі). Автоматична поправка результатів на кислотно-лужний баланс, температуру, питома вага і колір сечі. Прилад має чотири довжини хвилі. Спеціальний колірної сенсор і цифрова система обробки сигналу виключають помилки, пов'язані з освітленням в лабораторії і індивідуальними особливостями кольоросприйняття. Аналіз повністю автоматизований, можлива одночасна завантаження до 110 зразків, по 4 мл зразка в пробірці. Автоматична завантаження та нанесення зразка і витримка часу реакції. Точне нанесення зразка виключає перехресне забруднення зон. Є можливість термінового тестування одного зразка або групи зразків. Калібрування по калібрувальним смужкам і калібрувальним рідин. Простий дружній інтерфейс. Вбудований рідер штрих-кодів, що розпізнає Code 128, Code 39, Interleaved 2 або 5 коди. Можливе підключення до аналізатора сечових осадів. Автоматизований збір використаних смужок і рідин. Деталі, що контактують з сечею, виготовлені з особливого матеріалу, який має антибактеріальну дією і легко чиститься. Продуктивність 240 тестів на годину

 

2.4.1 Основи принципу  визначення біохімічних показників  сечі за допомогою тест смужок  «Citolab 10»

 

2.4.1.1 Інструкція

Використання

Реагентні смужки призначені для експрес аналізу сечі з метою виявлення уробіліногену, глюкози, білірубіну, кетонів (ацетооцтової кислоти), питомої ваги, крові, pH, білку, нітритів, лейкоцитів. Лише для in vitrо діагностики. Облік результатів тестування проводиться візуально шляхом порівняння реагентної смужки зі шкалою кольорів, яка нанесена на контейнер або за допомогою аналізатору. При візуальному проведенню обліку результатів необхідно дотримуватись усіх настанов, які вказані в даній інструкції, а при використанні аналізатора – керівництва з експлуатації апарату.

 

Процедура тестування

 

Для отримання вірних результатів  слід дотримуватися процедури тестування.

1. Дістаньте смужку із контейнера і відразу закрийте його кришечкою. Огляньте смужку. Тест-смужка не придатна для використання, якщо тестова ділянка знебарвлена чи потемніла.
2. Занурте тестову ділянку смужки в сечу не більш ніж на 2 секунди.
3. Проведіть ребром смужки по краю ємкості для того, щоб видалити залишки сечі, при цьому, тестова ділянка не повинна торкатися  краю ємкості.
4. Тримаючи смужку в горизонтальному положенні, промокніть її адсорбуючим матеріалом для остаточного видалення залишків сечі. Надлишок сечі може привести до взаємодії реактивів сусідніх зон на тестовій ділянці і як результат до появи невірних результатів тестування. 
5. Облік результатів тестування проведіть через 60 секунд, а для визначення лейкоцитів – через 90-120 секунд, при відмінному освітленні шляхом порівняння результатів тестування зі шкалою кольорів на контейнері. Під час обліку результатів смужку слід тримати в горизонтальному положенні для того, щоб уникнути взаємодії реактивів сусідніх зон на тестовій ділянці у випадку надлишку сечі.              

 

 

2.4.1.2 Визначення  показників

2.4.1.2.1. Уробіліноген (Urobilinogen)

Реагентні зони

Принцип: в основі лежить модифікована реакція Ерліха. Присутній у зразку уробіліноген реагує із реактивом Ерліха в результаті чого утворюється сполучення рожевого кольору. Реагентна зона змінює колір від світло оранжевого через рожевий до темно рожевого в залежності від вмісту уробіліногену в зразку.

Реагенти: 4-метоксібензедіазонія 2,9 мг.

Очікувані результати: в нормі концентрація уробіліногену в сечі становить від 0,1 до 1,0 Од. Ерліха/дл (мг/дл). Якщо результат перевищує 2,0 мг/дл, необхідно додаткове обстеження пацієнта і подальше дослідження сечі.

Пороговий рівень: чутливість тесту становить 0,1 Од. Ерліха/дл. Проте негативний результат не встановлює факт відсутності уробіліногену в сечі. У пацієнтів з підвищеним рівнем екскреції уробіліногену результат даного тесту корелюється із   результатами спектрофотометричного методу Уотсона – Шварца. 

Обмеження методу: дана реагентна зона може вступати в реакцію з тими речовинами, які взаємодіють із реагентом Ерліха, наприклад, р-аміносаліцилова кислота. Ліки, які містять азогантризин, можуть давати золотисте забарвлення реагнетної зони, що може маскувати результат. Тест не використовується для визначення порфобіліногену.

2.4.1.2.2. Глюкоза (Glucose)

Принцип: глюкооксидаза каталізує окисленння глюкози з утворенням пероксиду водню, який за участю пероксидази потім окислює хромоген реагентної зони.

Реагенти: глюкооксидаза 430 Од.; пероксидаза 200 Од.; йодид калію 12 мг.

Очікувані результати: в нормі глюкоза в сечі не визначається, хоча все ж таки може виділятися з сечею в незначній кількості. Реагентна зона може визначити глюкозу в концентрації біля 50 мг/дл. Концентрація глюкози на рівні 100 мг/дл вважається патологією.

Пороговий рівень: мінімальний рівень визначення глюкози становить біля 50 мг/дл. Даний тест є високо специфічним у визначенні глюкози. Реагентна зона не реагує із лактозою, галактозою, фруктозою та метаболітами лікарських препаратів (саліцилатів та налідиксової кислоти). 

Обмеження методу: наявність аскорбінової кислоти (більш ніж 50 мг/дл) та кетонових тіл (більш ніж 40 мг/дл) можуть дати хибнонегативний результат для проб, які містять малу кількість глюкози (100 мг/дл). Проте, на практиці подібне поєднання таких рівнів кетонів із низьким вмістом глюкози є метаболічно малоймовірним. Реакційна здатність тесту знижується із збільшенням питомої ваги та рН сечі, а також може залежати від температури. 

 

2.4.1.2.3. Білірубін (Bilirubin)

Принцип: реакція азопоєднання білірубіну із сіллю діазонію в кислому середовищі з утворенням азобарбника. Реагентна зона змінює колір із жовтуватого до бежевого та рожевого. 

Реагенти: нітрит натрію 0,733 мг, 2,4-дихлорбензолдіазонію 2,3 мг, сульфосаліцилова кислота 25 мг.

Очікувані результати: В нормі білірубін не повинен визначатися в сечі навіть самими чутливими методами. Виявлення навіть слідів білірубіну підтверджує патологію і потребує подальшого дослідження.