Биохимия мочи

 

 

 

2.2 Правила забору сечі для біохімічного дослідження

 

Найкраще збирати сечу, що накопичилася в організмі тварини за ніч, вранці до годування тварини, або, в крайньому випадку, після того, як тварина не мочилась 4-5 годин. Бажано проводити дослідження ранкової порції сечі , так як в ній накопичується більша кількість циліндрів, бактерій і клітин. Відбирається середня при сечовипусканні порція сечі в чистий посуд. Якщо сечу відбирають в один посуд, а доставляють у лабораторію в іншій,то необхідно ретельно перемішувати пробу сечі перед перенесенням в інший посуд, щоб на дні не залишилися елементи осаду. Посуд, в який збирають сечу і в якій відправляють сечу на дослідження, повинна бути чистою і без будь-яких слідів миючих або дезінфікуючих засобів, особливо хлорвмісних . Залишкові кількості дезінфектантів призводять до спотворення результатів багатьох тестів, зокрема вони змінюють рН сечі і дають хибнопозитивні тести на білок, кров'яні пігменти і глюкозу .

В ідеалі сечу необхідно  досліджувати протягом півгодини після  збору. Якщо це неможливо, то сечу слід охолодити до температури 2-4^о С в холодильнику , а потім направити для дослідження. Охолоджений до 4^о С зразок може зберігатися 1 - 2 години, максимум 4 години. Дослідження слід проводити , коли сеча нагріється до кімнатної температур , так як при дослідженні охолодженої сечі може спостерігатися помилкова кристалурія.

 Іноді сечу відбирають  методом катетеризації або методом  проколу сечового міхура.

При отриманні образу сечі методом катетеризації не потрібно чекати довільного сечовипускання, можна отримати достатній обсяг практично не забрудненої бактеріями сечі. Але при проведенні катетеризації існує ризик пошкодження слизової оболонки і розвитку ятрогенного циститу . 
Цистоцентез дозволяє швидко отримати стерильний зразок сечі, що зручно для проведення бактеріологічних досліджень . Однак цей метод протипоказаний при перерозтяганні сечового міхура внаслідок обструкції сечових шляхів, а також якщо сечовий міхур недостатньо наповнений . 
Зазвичай для первинного дослідження сечі в більшості випадків достатньо збору порції сечі при природному сечовипусканні.

Консервування сечі. Якщо неможливо провести дослідження протягом 1-2 годин сечу консервують.

Для цього використовують:

1) тимол - 1,0 мл на літр сечі (він може перешкодити визначенню білка по Геллеру),

2) толуол або ксилол - тонким шаром на поверхні сечі,

3) хлороформ - кілька мл на літр сечі (розчиняє жири, заважає визначенню цукру): перед дослідженням для його видалення сечу підігрівають;

4) 0,5%-ний розчин бензойного натрію (заважає визначенню цукру),

5) 0,3%-ний бензойної кислоти (дає позитивну реакцію при редукційних пробах);

 6 ) формальдегід - 4 краплі 40%-ного розчину на 50 мл сечі (зберігає організовані опади, але заважає в більшості хімічних досліджень).

 

2.3 Лабораторні  методи біохімічного дослідження  сечі

 

2.3.1 Якісні і кількісні проби на білок

 

Принцип. Якісні проби на білок основані на коагуляції його хімічним реактивом або фізичними методами (наприклад нагріванням). При наявності білка з’являється помутніння або випадає білий осад у вигляді пластівців.

Умови визначення білку в  сечі:

1. Сеча повинна мати кислу реакцію. Сечу лужної реакції підкисляють декількома краплями оцтової кислоти (5-10%). Надлишок оцтової кислоти ( а також інших кислот) викликає утворення розчинниш ацидальбумінів, що призводить до перетворення позитивних проб в негативні.
2. Сеча повинна бути прозорою. Помутніння усувають фільтруванням через паперовий фільтр. Якщо помутніння не зникає, додають інфузорну землю, тальк або палену магнезію (близько 1 чайної ложки на 100 мл сечі), збовтують і фільтрують
3. Якісну пробу слід проводити в двох пробірках, одна з яких контрольна.
4. Шукати помутніння слід шукати на чорному фоні при пронизуючому світлі.

ЯКІСНІ ПРОБИ.

Проба з сульфосаліциловою кислотою.

Реактив. 20% розчин сульфосаліцилової кислоти. Її готують наступним чином: до 20г саліцилової кислоти додають 18-20мл концентрованї сірчаної кислоти. Поступово нагрівають до 95-100^о.  Суміш перетворюється в кристалічну масу сульфосаліцилової кислоти. Остудивши, розводять водою до об’єму 150мл. Отримуємо 20% розчин сульфосаліцилової кислоти.

Хід реакції. До 3-4мл профільтрованої сечі додають 4-6 крапель реактиву. При позитивній пробі з’являється помутніння. Надлишок сульфосаліцилової кислоти може призвести до розчинення білку, проба з позитивної стає негативною. Проба з сульфосаліциловою кислотою вважається однією з найчутливіших.

Кільцева проба (проба Геллера)

Реактив 1. Азотна кислота концентрована (можна 50% розчин) або  реактив Ларинової. Насичений розчин хлориду натрію: 20-30г солі розчиняють в 100мл води при підігріванні і дають відстоятися до охолодження. Надосадову рідину зливають, фільтрують. До 99мл фільтрату додають 1мл міцної азотної кислоти. Замість азотної кислоти можна додати 2мл концентрованої соляної кислоти.

Хід реакції.  В пробірку наливають 1-1,5мл азотної кислоти або реактив Ларинової і піпеткою, обережно, по стінці пробірки нашаровують сечу, намагаючись не збовтувати рідину в пробірці. При наявності білку на межі двох рідин з’являється біле кільце.

Білі кільця, що зявляються вище межі нашарування, утворюються за рахунок випадіння солей. Ці кільця зникають при обережному підігріванні. Проба з реактивом Ларинової має ряд переваг

• На межі нашарування не буває пігментних кілець, що часто утворюються при нашаруванні сечі на азотну кислоту і заважають розпізнаванню білкового кільця
• Кільця виходять чіткіші ніж з азотною кислотою
• Економія азотної кислоти
• Реактив більш зручний в роботі, потрапляючи на тканину не пропалює її

 

КІЛЬКІСНІ ПРОБИ

Спосіб Брандберга (Робертса-Стольникова).

Принцип. Використовують кільцеву пробу, на реактив нашаровують сечу, розведену в певну кількість разів. Проба дає позитивний результат при вмісті білка 33мг% (0,033г%). Ниче цієї концентрації проба негативна. Якщо при нашаруванні сечі на азотну кислоту на межі двох рідин зявляється тонке біле кільце між 2-ю і 3-ю хвилиною, то в досліджуваній сечі міститься 0,033% білку.

Хід реакції. В пробірку наливають 1-1,5мл азотної кислоти або реактиву Ларинової і нашаровують сечу. Відмічають час після нашарування. При появі білкового кільця раніше 2хв після нашарування сечу варто розвести з водою. Після чого проводять повторне нашарування розведеної сечі. При чому обирають розведення сечі так, щоб кільце утворювалось між 2-ю і з-ю хвилинами. Кількість білка вираховують шляхом множення 0,033% на ступінь розведення. Ступінь розведення обирають в залежності від виду первинного кільця, тобто від ширини, компактності і часу його появи. При нитковидному кільці сечі розводять в 2 рази, при широкому – в 4 рази, при компактному – в 8 разів.

Метод кількісного  визначення загального білка в сеч і з сульфосаліциловою кислотою.

Принцип. Білок з Сульфосаліциловою кислотою дає помутніння, інтенсивність якого залежить від концентрації білка. Вимірювання проводять на фотоелектроколориметрі.

Реактив. 3% розчин сульфосаліцилової кислоти.

Хід реакції. В центрифужнц пробірку (краще градуйовану) наливають 1,25мл профільтрованої сечі, доливають до 5мл 3% розчином сульфосаліцилової кислоти. Через 5хв визначають оптичну щільність на ФЕК проти контролю. Світлофільтр оранжевий №7 ( довжина хвилі 650-590), кювета з робочою шириною 5мм.

Примітка. При великій концентрації білка розведення проводять звичайним способом.

Контроль. В центрифужні пробірки наливають 1,25мл профільтрованої сечі і доливають до 5мл 0,9% розчинам натрія хлориду. Проводять вимірювання на ФЕК при тих же умовах, що й дослідні проби. При розрахунку з оптичної щільності досліду вираховують оптичну щільність контролю.

Розрахунки ведуть по калібрувальному  графіку, для побудови якого готують  розведення зі стандартного розчину  альбуміну в 0,9% розчині натрію хлориду  з концентрацією білка 5, 10, 20, 50 и 100мг%. З кожного розведення беруть 1,25мл и обробляють як дослідні проби. Прямолінійна залежність при побудові калібрувального графіку зберігається до концентрації 10мг%.

Альбумози (протези). Альбумози – це продукти розщеплення білків.

Принцип. В основі визначення альбумозів лежить те, що вони не згортаються при кип’ятінні, дають позитивну біуретову реакцію і висолюються деякими солями, особливо сульфатом амонію і ацетатом цинку в кислому середовищі.

Хід реакції. До сечі, підкисленої оцтовою кислотою, додають насичений розчин натрію хлориду (1/3 об’єму), кип’ятять гарячу рідину фільтрують. Альбумзи проходять у фільтрат, в якому їх наявність визначають біуретовою реакцією. До фільтрату додають ½ об’єму концентрованого розчину їдкого натру і декілька крапель слабкого розчину сульфату  міді. При позитивній пробі отримуємо червоно-фіолетове забарвлення.

При позитивній пробі з  суьфосаліциловою кислотою сечу нагрівають. Якщо мутність зникає і знову з’являється при охолодженні, це означає, що в сечі містяться альбумози або білкове тіло Бенс-Джонса.

 

Білкові фракції  сечі.

Якісний склад білків сечі визначають методом електрофорезу ( при якому білки сечі діляться на фракції).

Нормальна уропротеїнограма: альбуміни – 20%, α₁-глобуліни – 12%, α₂-глобуліни – 17%, β – глобуліни – 43%, γ-глобуліни – 8%.

Білкові тіла Бенс-Джонса.

Білкові тіла Бенс-Джонса – це макромолекулярні пара протеїни, які випадають в осад при температурі 45-55^оС.

Методи  визначення. Найбільш надійним методом їх визначення є електрофорез на папері, при якому білковий розчин (сеча та ін..) наносять на спеціальну смужку фільтрувального паперу. Внаслідок амфотерних властивостей білків сироватки в електричному полі постійної напруги білки показують різну швидкість руху. Ця швидкість залежить від величини їх заряду, концентрації Н-іонів буферного розчину і від напруги струму. Окрім того, застосовується проба з кип’ятінням.

Хід реакції. До 10мл сечі додають 3-4 краплі 10% розчину оцтової кислоти (рН сечі 5,0-6,0), реакція йде краще, якщо додати невелику кількість насиченого розчину натрію хлориду. Обережно нагрівають на водяній бані, поступово піднімаючи температуру. Якщо в сечі наявні білкові тіла Бенс-Джонса, то при температурі 45-60^оС зявляється дифузне помутніння або випадає осад. Коли осад випав, додають 1-2 краплі слабкого розчину оцтової кислоти до слабо кислої реакції, нагрівають до кипіння. Осад при цьому розчиняється. При охолодженні знову зявляється помутніння і осад. Ця проба малочутлива.

 

2.3.2 Якісні і кількісні проби на глюкозу

 

ЯКІСНІ ПРОБИ

 

Використовуються проби, основані редуцируючій здатності глюкози, і глюкозооксидазні проби, які відрізняються високою специфічністю.

 

Проба Бенедикта.

 

Принцип. Реакція основана на властивості глюкози відновлювати в лужному середовищі гідрат окису міді(жовтий колір) або окис міді (червоний колір).

 

Приготування  реактиву. В мірну колбу ємністтю1л наливають 700мл води, дадоють 173г цитрату натрію, 100г безводного (або 200г кристалічного) карбонату натрію. Нагрівають до розчинення. Окремо розчиняють 17,3г сульфату міді в 100 мл води. Змішують обидва розчини, безперервно збовтують. Після охолодження доливають до 1л.

 

Хід реакції. В пробірку наливають 5мл реактиву і додають 8-10 крапель сечі. Пробу нагрівають 2хв на полум’ї або 5хв в киплячій водяній бані. Дають пробірці вистигнути 5-7хв. За наявності глюкози з’являється зелене, жовте або червоне забарвлення рідини з осадом. При зеленому забарвленні без наявності осаду проба вважається негативною.

Проба Бенедикта вважається найнадійнішою, так як при великому розведенні сечі (8-10 крапель сечі і 5мл реактиву) відновлюючи властивість  інших редукуючи речовин сечі виражена слабко.

 

Проба Гайнеса.

 

Приготування  реактиву.

1. 13,3г хімічно чистого кристалічного сульфату міді розчиняють в 400мл води.
2. 50г їдкого натру розчиняють в 400 мл води.
3. 15г чистого гліцерину розводять в 200мл води.
4. Змішують перший реактив і в цей же час приливають третій.

Реактив досить стійкий.

Хід реакції. До 3-4мл реактиву додають 8-12 крапель сечі, кип’ятять або ставлять в киплячу водяну баню. За присутності глюкози з’являється жовте або червоне забарвлення рідини і осад. На практиці більш прийнятна наступна модифікація: 1 краплю сечі і 9 крапель реактиву доводять до кипіння. При відсутності глюкози колір реактиву не змінюється (синій).