Место цитогенетического мониторинга в системе исследования загрязнения окружающей среды. Методы цитогенетического мониторинга

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«Воронежский государственный университет»

ФГБОУ ВПО «ВГУ»

 

 

Биолого-почвенный факультет

Кафедра генетики, цитологии и биоинженерии

 

 

 

 

Место цитогенетического мониторинга в системе исследования загрязнения окружающей среды. Методы цитогенетического мониторинга

 

 

 

 

Выполнила: студентка

биолого-почвенного факультета

4 курса, 11 группы  Кущева  И.В.

                                                                      Проверил: к.б.н., асс., Белоусов М.В.

 

 

 

Воронеж-2013

Cодержание

ВВЕДЕНИЕ	3
1 УЧЕТ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В МИТОЗЕ И МЕХАНИЗМЫ ИХ    ОБРАЗОВАНИЯ	5
2 МЕЙОТИЧЕСКИЙ ТЕСТ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОМ    МОНИТОРИНГЕ	7
2.1 Влияние ионизирующего излучения на частоту хромосомных аберраций       в мейозе	8
2.2 Действие кислорода. Кислородный эффект	11
2.3 Факторы среды и другие неучтенные факторы	12
2.4 Микроспорогенез как показатель в оценке действия загрязнителей среды	14
2.5 Митотическая активность как показатель антропогенной нагрузки в системе       цитогенетического мониторинга	16
2.6 Разработка шкалы чувствительности критериев Цитогенетического мониторинга	18
Заключение	20
Список литературы	21

 

 

 

 

 

 

Введение

В состав генетического мониторинга входит цитогенетический мониторинг, задачей  которого является регистрация возникающих под действием антропогенных факторов изменений в структуре генофонда и прогнозирование темпов ее перестройки[3]. Но цитогенетический мониторинг может быть использован не только как составляющая часть генетического мониторинга. В экологическом мониторинге он дополняет генетические данные и результаты исследований по воздействию загрязнителей и позволяет решить две задачи: составить полную картину при экспертизе биологических последствий загрязнения, оценить роль антропогенных воздействий на стабильность сортов растений, от которых зависит их продуктивность[1].      

 Мутационный груз, возникающий  в растительных популяциях в  результате влияния антропогенной  нагрузки, можно сравнительно быстро  определить с помощью современных  цитогенетических методов, используя  один из основных  цитогенетических критериев - частоту клеток с перестройками хромосом в первых митозах меристемы корней. Это позволяет установить различия между  популяциями из загрязненных и контрольных районов[2].  Учет  аберраций хромосом можно проводить на стадии метафазы (метафазный метод) или на стадии поздней анафазы и ранней  телофазы (ана-телофазный  метод). Оба метода имеют как преимущества, так и недостатки. 

Метафазный  метод более точен. Он дает возможность  выявить в 1,5 раза больше мутаций и позволяет учесть с предельной точностью все типы хромосомных и хроматидных перестроек, а также геномные мутации. Вместе с тем он является достаточно  трудоемким и связан с  определенными ограничениями в выборе объектов для исследований. Так, наиболее результативен он при использовании видов с небольшим числом крупных, хорошо идентифицируемых хромосом. Создаются затруднения при изготовлении давленых препаратов высокого качества [4].

При использовании ана-телофазного метода для анализа пригодна почти каждая делящаяся клетка. Этот метод менее точен. Он позволяет учесть лишь некоторые типы хромосомных аберраций. Его принято считать экспресс-методом для предварительной оценки активности тех или иных агентов. Тем не менее,   ана-телофазный метод широко применяется для выявления мутагенных эффектов [5].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. УЧЕТ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В МИТОЗЕ И МЕХАНИЗМЫ ИХ ОБРАЗОВАНИЯ 

 

В основе структурных перестроек лежит свойственная всем хромосомам способность при определенных условиях разрываться на части, фрагментироваться [6].Происхождение и судьба разных типов аберраций хромосом неодинакова. Одним из наиболее важных факторов принято считать установление зависимости между митотическим циклом и реакцией хромосом на действие антропогенной нагрузки. В результате антропогенного воздействия на хромосомы на разных стадиях ядерного цикла образуются разные типы перестроек, которые обусловлены, в основном, самой структурой хромосом в каждой данной стадии.  В стадии G1 хромосома ведет себя как отдельная нить. Возникают межхромосомные обмены, кольца, хромосомные делеции и  сложные хромосомные перестройки. В  стадию S хромосома обнаруживает двойственную структуру, субнити которой ведут себя самостоятельно, образуя полухроматидные концевые делеции, полухроматидные межхромосомные обмены (транслокации), полухроматидные интерстициальные  делеции (микрофрагменты), изо- полухроматидные делеции, а  также полухроматидно-изополухроматидные трирадиалы. 

В  стадию G2 образуются хроматидные перестройки: концевые делеции, изосестринские делеции, симметричные и ассиметричные межхромосомные хроматидные обмены, трирадиалы[7]. При повреждении двухроматидной хромосомы образуется ацентрический фрагмент и укороченная хромосома. Если при соединении разорванных концов исходная структура восстанавливается,  то никаких перестроек не происходит. При двух близких одновременных разрывах случайное соединение  четырех свободных концов обуславливает различные аберрации обменного типа. В анафазе - телофазе митоза фрагмент обнаруживается между полюсами. Судьба фрагментов ( одиночных и множественных) различна. Они могут попасть в одно из дочерних ядер, резорбироваться или образовывать дополнительное микроядро[8]. Мост является следствием фрагментации двух хромосом. При воссоединении фрагментов, содержащих центромеры, образуется дицентрическая хромосома, которая  испытывает воздействие обоих митотических центров, и, растягиваясь между дочерними группами анафазных-телофазных хромосом, образует мост. Аналогично на стадии G2 и S образуется хроматидный мост [9]. 

Отставания хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам возникают при повреждении хромосомы в области кинетохора. Или это может быть связано с действием антропогенных веществ на мембраны митохондрий так, что из этих органелл в цитоплазму выходит кальций. Повышения уровня кальция может подавлять формирование белковых микротрубочек, а следовательно, и образования митотического веретена. Окончательным итогом будет нерасхождение хромосом в митозе. Отставшие хромосомы либо разрушаются и элиминируют из клетки, либо формируют дополнительное микроядро[10]. 

Перестройки хромосом (хромосомные аберрации, хромосомные мутации) подразделяют на два основных типа: симметричные и асимметричные. Первый тип связан с образованием в результате перестройки отдельных хромосом с одной центромерой, второй - с появлением ацентрических и дицентрических фрагментов. 

При анализе перестроек в анафазе учитываются лишь асимметричные перестройки: фрагменты, кольца ( замкнувшиеся фрагменты, образовавшиеся в результате двух разрывов), хромосомные и хроматидные мосты. Мосты могут быть образованы дицентрическими хромосомами, возникающими либо в результате транслокаций, либо изохроматидных делеций. Могут возникать мосты также из дицентрических колец [11].

 

 

 

 

2. МЕЙОТИЧЕСКИЙ ТЕСТ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ 

 

Ввиду большой чувствительности к внешним воздействиям, мейоз представляет собой удобную систему для генетического мониторинга [12]. Анализ мейоза может дать наиболее полную информацию о генетических последствиях тех или иных воздействий на растения. Клетки спорогенной ткани дифференцируются на ранних стадиях онтогенеза и развиваются в течение всего жизненного цикла  растения. Большие размеры ядра и хромосом в профазе мейоза и большая продолжительность мейоза по сравнению с митозом, что делает ядро в стадии мейоза более чувствительным к антропогенной нагрузке. Кроме повышения уровня аномалий в мейозе, увеличивается частота полностью стерильных растений. Отмечено уменьшение числа археспориальных клеток в пыльниках, дегенеративное изменение пыльцы [13] .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.1.Влияние ионизирующего излучения  на частоту хромосомных аберраций  в мейозе 

 

Чувствительность клеток к излучению может быть разной в связи с различным физическим состоянием молекул в протоплазме. Это обстоятельство имеет большое значение, так как в различные периоды жизнедеятельности клетки физические свойства ее макромолекул и структур меняются.

Опыты по использованию микропучков для облучения отдельных структур и участков клетки показали, что наиболее губительно излучение действует на ядро и хромосомы. В облученных клетках происходят обратимые и необратимые изменения: пикноз ядра, склеивание хромосом, фрагментация хромосом, образование гигантских ядер и многоядерных клеток, нарушение полярности делений, возникновение ядер с различным числом хромосом. Частота и характер хромосомных аберраций зависит от дозы облучения и от того, в какой период митотического и мейотического циклов было произведено облучение. Воздействие возможно в двух состояниях хромосом: 1) на недуплицированные хромосомы (интерфаза, период G1); 2) на дуплицированные хромосомы (профаза, метафаза, период G2 ). 

Облучая микроспоры традесканции рентгеновскими лучами, Сакс установил, что при этом возникают простые терминальные делеции и изохроматидные аберрации, частота которых линейно возрастала с увеличением дозы. Выход таких аберраций не зависел от фактора времени. Результаты этих опытов позволили Саксу заключить, что разрывы хромосом, происходящие при облучении, не зависят друг от друга, и частота их прямопропорциональна дозе облучения. Предполагалось, что часть разрывов может остаться невоссоединенной и явиться причиной делеций. Большая же их часть воссоединяется, восстанавливая исходную структуру, а при неправильном слиянии приводит к обмену фрагментами. Обычно в обмене участвуют те разрывы, которые находятся в непосредственной близости друг от друга[14].

Сейчас есть данные о том, что цепи ДНК в процессе репликации подвергаются разрывам. Если эти разрывы заживляются при участии ферментов, осуществляющих пострепликативное восстановление после облучения или последние этапы восстановления по механизму выщепления ресинтеза, то мутации чувствительности к ионизирующим излучениям должны вести к увеличению спонтанной летальности или спонтанной мутабельности.

Ли и Кетчсайд в 1942 году  показали, что разрывы под действием радиации образуются в результате нескольких актов ионизации, происходящих внутри хромосомной нити или около нее. Существование двух независимых эффектов радиации  ( разрыв и соединения ) было хорошо доказано на разных объектах. Например, разрывы хромосом микроспор традесканции остаются способными к соединению в течение 20-30 минут после облучения [15]. 

По классической теории образования аберраций радиация вызывает множество разрывов хромосом,значительная часть которых соединяется.Большинство оставшихся разрывов вовлекается в обмен,а остальные проявляются в метафазе.Таким образом,разрывы хромосом и хроматид рассматриваются как последствия первичного радиобиологического эффекта,который реализуется в ходе интерфазы [13].

Предполагается, что хромосомный тип аберраций возникает при действии облучения до репликации хромосом, а хроматидный - при облучении реплицированных хромосом. Многими исследователями доказано, что период S разделяет время образования хромосомных и хроматидных аберраций. Иначе говоря, облучения в пресинтетический период вызывает аберрации хромосомного типа, а в постсинтетический - хроматидного типа. С наступлением синтетического периода частота хромосомных разрывов резко снижается, а хроматидных – возрастает.

Единственным точным методом оценки действия радиации на живые клетки является прижизненное наблюдение облученных клеток. В данном случае можно непосредственно установить контроль за определенной клеткой сразу после облучения и без малейших погрешностей определить фазу на которой она была облучена. В тех случаях, когда непосредственного наблюдения за облученными клетками установить нельзя, прибегают к фиксации материала через определенное время после облучения. Поскольку учет перестроек хромосом можно производить только в метафазе, анафазе и ранней телофазе, то зная время в момент облучения и в момент фиксации, а также продолжительность каждой фазы, можно высчитать, в какой фазе была облучена клетка [16]. Нужно знать, сколько времени продолжается каждая фаза в цикле клеточного деления каждого растения. Например, для лука репчатого при 20 °С интерфаза продолжается 20 - 26 часов, от ранней профазы до анафазы проходит два часа, анафаза и телофаза вместе длятся около 45 минут, весь цикл деления клетки продолжается 23 - 29 часов. В другом литературном источнике указаны иные данные: общая длительность митотического цикла у Allium cepa составляет 13-15 часов при  температуре 24-25 °С. 

Зная длительность промежутка времени от момента облучения до фиксации и наблюдая состояние клетки после фиксации можно определить, в какой фазе находилось ядро клетки во время облучения.   
Пыльник обычно содержит до 1000 клеток, пригодных для наблюдения. Поскольку различные бутоны в одном соцветии содержат микроспоры в последовательных фазах развития, то при одной экспозиции можно обработать клетки на различных стадиях.

 

 

 

2.2 Действие кислорода. Кислородный эффект 

 

Кислород, находящийся в среде, может значительно усилить действие облучения. При удалении кислорода чувствительность к облучению уменьшается в два-три раза. Это так называемый кислородный эффект, и его, по-видимому определяют клеточные мембраны.