Теоретические основы электрофоретического разделения белковых смесей

Виды зонального электрофореза:

1. на бумаге
2. на полосках ацетата целлюлозы
3. гель-электрофорез

 

Гель-электрофорез

Наилучшего разделения макромолекул, в частности, белков и нуклеиновых кислот, можно достигнуть, если в качестве носителя использовать гели крахмала, полиакриламида, агарозы и агарозы-акриламида. Такой эффект, очевидно, связан с пониженной диффузией макромолекул в сетке геля и дополнительным разделяющим действием гель-проникающей хроматографии (эффект «молекулярного сита»).

 

Электрофорез в крахмальном геле

Первоначально для гель-электрофореза  применяли крахмальный гель.

 Крахмальный гель был первой  поддерживающей средой, обладающей  свойствами  молекулярного сита, которую использовали для электрофоретического  разделения веществ.

Крахмал- это нерастворимый в воде полисахарид, который в нативном состоянии связывает небольшое количество воды и при этом набухает. В крахмале большинства растений на долю амилопектина приходится 70-90%, а остальные 10-30% составляет амилоза, однако, содержание этих компонентов может изменяться в зависимости от сорта растения. путем частичного кислотного гидролиза  смесью ацетона и концентрированной НСI картофельный или рисовый крахмал при 37⁰С может быть переведен в твердый гидрогель.

На размер пор геля влияет концентрация крахмала и степень  его очистки. Размеры пор крахмального геля обычно варьируют в незначительных пределых, поскольку при резких изменениях степени гидролиза и концентрации геля ухудшаются его механические характеристики. В связи с этим электрофорез в крахмальном геле применяют для разделения белков с малями молекулярными массами. Очень крупные молекулы такие,  как иммуноглобулин М (900 кДа), или ассиметричные молекулы, как фибриноген, не могут проникать в поры крахмального геля. Сеть полисахаридных цепей, образующих матрикс крахмального геля, не является абсолютно жесткой и обладает достаточной подвижностью и гибкостью при перемещении белков через нее в электрическом поле. крахмальный гель обладает хорошими антиконвекционными свойствами и с успехом используется для разделения белковых компонентов, мало различающихся электрофоретической подвижностью. Так, электрофорез в крахмальном геле неоднократно применяли для изучения гетерогенности гемоглобина человека и различных животных. Разработаны приборы для горизонтального и вертикального электрофореза в крахмальном геле. после окончания электрофореза крахмальный гель переносят в специальный лоток и разрезают вдоль на узкие полоски, а затем окрашивают на присутствие белка (амидовым черным 10В, нитрозином) или на проявление ферментативной активности.

Недостатками крахмального геля как носителя для электрофореза  являются его недостаточная стандартизация и высокая степень электроосмоса.

 В настоящее время крахмальный  гель используется редко, поскольку более удобным с многих точек зрения оказался полиакриламидный гель.

 

Электрофорез  в агаровом и агарозном гелях

Агар- это природный длинейный полисахарид, выделяемый из клеточных стенок морских водорослей. Точная структура его неизвестна, но установлено, что в его состав входят два полисахарида: агароза и агаропектин, а также около 6% сульфата. Агар  растворяется в воде при нагревании на кипящей водяной бане. Растворы полисахарида остаются жидкими при снижении температуры до 40 0С и застывают при 38 0С. Повторно растворить агар можно только в кипящей воде. Агаровый гель механически прочен. Он содержит поры, размер которых зависит от его концентрации. Присутствие в агаре значительного количества отрицательно заряженных групп (сульфатных и карбоксильных) придает ему некоторые ионогенные свойства. Однако из-за низких используемых концентраций геля (порядка 1 %) емкость агара невелика. иммобилизованные на нитях геля заряженные группы не могут перемещаться в электрическом поле, но соответствующие им положительно заряженные ионы находятся в водной фазе под действием электрического тока мигрируют в направлении катода. Их место занимают катионы. поступающие из анодного буферного раствора. Таким образом возникает электроосмотический ток, направленный в противоположную сторону перемещения вещества. Он  увлекает за собой всю массу жидкости. находящуюся внутри геля, а вместе с ней растворенные в водной фазе макромолекулы. что влияет на скорость их миграции и приводит к ухудшению (искажению) профиля разделения исследуемого вещества.

Одним из недостатков  данного метода является то, что  результаты электрофореза на агаровых гелях, полученных из разных источников, не совпадают. По-видимому это связано с влиянием загрязнений на величину электроосмоса, поэтому необходима дополнительная очистка агара. Другим уязвимым местом электрофореза на агаровом носителе является сильное взаимодействие белков с сульфатными группами агара. Данные недостатки в значительно меньшей степени присущи агарозе.

Агароза- особо очищенная фракция агара. получаемая из него методом ацетилирования. Она содержит только 0,04% сульфата. Агароза затвердевает при 36-42 0С, превращаясь в гель. Формирование сетки геля происходит за счет образования водородных связей

между цепями полисахарида, поэтому агароза чувствительна к воздействию реагентов, разрушающих водородные связи. Она устойчивав интервале рН 4-9 и температуры от 1 до 40 0С. Гели агарозы не вполне прозрачны, что обусловлено не наличием примесей в них, а процессом «кристаллизации» геля и свидетельствуют о чистоте агарозы. Средний размер пор 2%-ного агарозного геля соответствует диаметру сферической молекулы биополимера с молекулярной массой около 50 млн Да. Эффект молекулярного сита при такой концентрации геля ничтожен. Поэтому в агарозном геле можно разделять в соответствии с их молекулярными массами такие крупные молекулы, как ДНК и РНК.

Выбор концентрации агарозы (и, следовательно, пористости геля ) зависит  от размеров фракционируемых макромолекул. Поры геля должны быть непроницаемы для молекул биополимеров и создавать незначительное трение при их движении, поэтому для электрофореза используют агарозы с концентрацией 0,4-2 %.

Коммерческие фирмы  выпускают агарозу для электрофореза  в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля навеску порошка растворяют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане при 90-95 0С около 2 часов для образования истинного раствора полимера. Перед заливкой на пластину или в форму горячий раствор агарозы охлаждают до 50 0С и выдерживают не менее 1 часа в термостате при данной температуре. Это обеспечивает полное выравнивание температуры раствора по всему объему, последующее одновременное застывание геля и формирование его однородной структуры. Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию геля. Процесса электрофореза в агарозном геле обычно осуществляют при комнатной температуре

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Электрофорез  в полиакриламидном геле (ПААГ)

Полиакриламидный гель в виде поддерживающей среды при  проведении электрофореза использовал  Раймонд и Вейнтрауб (S. Raymond and L. Weintraub) в 1959 году. Теорию метода разработали Орнштейн (Ornstein L., 1964) и Дэвис (Davis B., 1964).

Полимеризация полиакриламидного геля

Для получения полиакриламидного  геля используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки – обычно N,N'- метиленбисакриламид (сокращенно – бисакриламид).

 

    CH₂ = CH                                                                       CH₂ = CH         

    ½                                                                                       ê                           

                C=O                                                                                C = O              

                ½                                                                                       ê                           

                NH₂                                                                                 NH                        

                                                                                                          ê                               

   Акриламид                                                                                 CH₂                           

                                                                                                          ê                               

                                                                                                        NH                        

                                                                                                          ê                            

                                                                                                         C = O                    

                                                                                                          ê                            

                                                                                             CH₂ = CH

                                                                                            Бисакриламид                            

 

Реакция полимеризации  протекает по свободнорадикальному механизму и требует наличия  свободных радикалов акриламида. В качестве инициаторов реакции  полимеризации используют вещества, разрушающиеся с образованием свободных радикалов, которые затем взаимодействуют с молекулами акриламида и запускают (инициируют) полимеризацию. Наиболее широко в качестве инициатора процесса полимеризации используют персульфат аммония (NH₄-SO₄-SO₄-NH₄) или калия, образующий в водном растворе за счет гомолитического разрыва связи радикалы (NH₄-SO₄^·). Рибофлавин также может служить инициатором полимеризации: при освещении его водного раствора видимым светом (445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лейкорибофлавина, который легко окисляется растворенным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет разложения перекиси продуцируются гидроксильные радикалы (НО^·), инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида. Поскольку реакция полимеризации акриламида – медленный процесс, то для ускорения процесса полимеризации в качестве катализатора обычно используют N,N,N',N' – тетраметилэтилендиамин (СH₃)₂ - N - CH₂- CH₂ -N -(CH₃)₂ (ТЕМЭД).

Возможно использование  следующих пар катализаторов и инициаторов:

1. Персульфат аммония + TEMЭД
2. Персульфат аммония + ДМАПН (3-диметиламинопропионнитрил)
3. Рибофлавин + TEMЭД (фотополимеризация)
4. Перекись водорода + сульфат железа + аскорбиновая кислота

Поскольку персульфат аммония  нестоек в водном растворе, его часто заменяют персульфатом калия.

Плотность геля (размер пор)

Для характеристики полиакриламидного  геля необходимо указывать процентное содержание мономеров. Стандартно используют следующие обозначения:

Т – процентное отношение  суммарной массы обоих мономеров к объему раствора,

С – процентное отношение  массы бисакриламида к общей  массе обоих мономеров. (Т = акриламид + мономер, образующий сшивки) и количество сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С):

Т = (a + b)/m * 100 %

C = b/(a + b) *100 %

a – количество акриламида;

b – количество мономера, образующего сшивки (бисакриламида);

m – объем буфера, мл.

Т обычно варьируется  в пределах 3-30%, а С 1-5%. Выбор значений С и Т определяется диапазоном фракционирования белков и ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля. Для крупнопористых гелей необходимо увеличивать степень сшивки (повышать С до 3-5%), для мелкопористых гелей величина С не должна превышать 1-2%.

На первый взгляд чем  больше Т, тем мельче поры, но это не всегда так, поскольку ПААГ не является регулярной пространственной решеткой с жесткими ячейками определенного среднего размера. При малых значениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных точках случайно сшитые между собой. Такая система не может быть внутренне жесткой. Поэтому мигрирующие в геле макромолекулы, по-видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных полимеров акриламида, при этом миграция молекул замедляется и происходит своеобразное трение их о гель. Однако жестких ограничений на размер мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это очень существенно.

Чем выше концентрация заполимеризованного  акриламида, тем меньше размер пор  в геле: p = 1,5 d / Ö` c

        где р – размер пор в ангстремах

       c – объемная концентрация акриламида

       d – диаметр молекулы акриламида

Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее  трение. Увеличение содержания «сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля, т.к. средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется. Однако далее картина меняется, экспериментально показано, что с увеличением С выше 10% тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С>15% гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам оказывается энергетически выгодным и вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Эта сетка оказывается действительно жесткой – нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров. Поэтому содержание сшивки С в геле должно быть в пределе 2-5%.