Теоретические основы электрофоретического разделения белковых смесей

Министерство образования  Республики Беларусь

Учреждение образования  «Международный государственный университет  имени А.Д.Сахарова»

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

«Электрофорез»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                 Студентки 3 курса ФЭМ, МБД

                                                 Группы 305-2

                                                 Махитко О.Г.

 

 

 

 

 

 

 

Минск 2011

 

Содержание

 

Введение………………………………………………………………………..3

1. Теоретические основы электрофоретического разделения

     белковых смесей……………………………………………………………4

   Виды электрофореза…………………………………………………..5

  Основные этапы электрофоретического анализа……………………6

  Факторы, влияющие на подвижность компонентов образца……….7

  Электрическое поле…………………………………………………...7

  Буфер…………………………………………………………………...8

  Носитель………………………………………………………………..9

  Электрофорез с подвижной границей……………………………….10

  Изоэлектрическое фокусирование…………………………………..11

  Зональный электрофорез и его разновидности зонального   

  электрофореза…………………………………………………………12

            Гель-электрофорез…………………………………………………….13

                  Электрофорез в крахмальном геле……………………………....13

        Электрофорез в агаровом и агарозном гелях…………………...14

2.  Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)………………………16

            Диск-электрофорез в полиакриламидном геле……………………..19

3.  Электрофорез белков в вертикальных пластинах……………………….21

  Электрофорез белков в полиакриламидном геле в

  присутствии додецилсульфата натрия………………………………23

Заключение…………………………………………………………………….25

Литература…………………………………………………………………….26

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Электрофорез - направленное движение коллоидных частиц или  макроионов под действием внешнего электрического поля. Электрофорез был ещё открыт Ф.Ф. Рейссом в 1807 и считается  одним из важнейших разновидностей электрокинетических явлений. Практическое применение электрофореза началось после создания шведским учёным А. Тиселиусом специального аппарата для фронтального (или свободного) электрофореза белков в растворе (1937).

Электрофорез используют в электрохимии для изучения двойного электрического слоя, адсорбции ионов на поверхности, в медицине. В промышленности электрофорез  используют для выделения каучука из латекса, очистки воды, отделения каолина от песка и др. В биохимии электрофорез служит для анализа, разделения и очистки биополимеров (главным образом белков), бактериальных клеток, вирусов, а также аминокислот, витаминов и др.  
Наиболее широкое распространение нашли электрофоретические методы с использованием инертных носителей (бумаги, гелей и др.), получившие общее название зонального электрофореза, т. к. фракции разделяемых веществ образуют в толще носителя отдельные, несмешивающиеся зоны. Электрофорез часто сочетают с другими методами разделения биоорганических соединений (например, с хроматографией). Разработана техника концентрирования электрофоретических зон биополимеров в гелях, значительно повышающая разрешающую способность метода (диск-электрофорез).

Применение реакции  антиген-антитело в сочетании с электрофорезом послужило основой для создания метода иммуно-электрофореза. Электрофоретический анализ биологических жидкостей, например сыворотки крови для исследования главным образом белков, широко используют в диагностике многих заболеваний.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Теоретические основы электрофоретического

разделения  белковых смесей

 

Электрофорез – это  перемещение заряженных частиц в  растворе (в зависимости от знака  их суммарного электрического заряда) к аноду или катоду под действием  электрического поля. Поскольку скорость движения молекул в электрическом поле зависит от их заряда, формы и размера, то электрофорез может быть использован для их разделения.

Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым  суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят в основном от рН среды. Если через этот раствор начать пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров макромолекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул мигрирующих с одной и той же скоростью. Однако в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны, поэтому обычно электрофорез проводят в гелеобразной среде. Наличие сетки геля приводит к тому, что теперь фракционируемые макромолекулы сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных молекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров.

Электрофорез позволяет  разделять макромолекулы, различающиеся  по таким важнейшим параметрам, как  размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура  и электрический заряд, причем эти  параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Биологические макромолекулы  – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и др. – находятся в водном растворе в виде частиц, несущих  определённый электрический заряд. Заряд макромолекулы определяется входящими в ее состав группами, способными к электролитической диссоциации. Степень диссоциации групп зависит от многих факторов, в частности, от рН среды. Общий заряд биологической макромолекулы также может изменяться при её взаимодействии с ионами или другими молекулами.

Наиболее широкое применение электрофорез получил для анализа и очистки белков и нуклеиновых кислот, хотя этот метод может быть использован и для других заряженных биологических молекул, таких как сахара, аминокислоты, пептиды, нуклеотиды и др. Для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез. Наиболее широко используются полиакриламидные (ПААГ) гели и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. В качестве других «носителей» жидкой фазы широко используют пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества.

 

Виды электрофореза

В настоящее время  разработано большое число разнообразных электрофоретических методов, которые базируются на свойствах белков и особенностях их взаимодействия с поддерживающей средой. применяемой при электрофорезе.

I. В зависимости от агрегатного состояния среды, применяемой при проведении электрофореза, различают:

• фронтальный (жидкостный) электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде;
• зональный электрофорез, при котором фракционирование происходит на закрепленной среде (на опорном материале или носителе), выполняющих роль стабилизатора образующихся фракций.

II. По способу нанесения образца электрофоретические методы делят на 3 вида.

1. Электрофорез с подвижной  границей, осуществляемый в свободной  (незакрепленной) среде: разделяемые  макромолекулы присутствуют во всем объеме раствора.

2. Зональный электрофорез  – исследуемый раствор наносят  в виде пятна или полосы  на поддерживающий носитель.

3. Метод электрофореза в свободном потоке (непрерывный электрофорез): разделяемая смесь непрерывно подается в протекающий слой буфера.

III. По принципу фракционирования выделяют следующие группы:

1. Электрофорез в среде  с постоянным значением рН: разделение  базируется на различиях в  величине заряда компонентов  смеси при данном значении  рН.

2. Изоэлектрическое фокусирование:  разделение осуществляется в градиенте рН и основывается на различиях в значении изоэлектрической точки индивидуальных компонентов.

3. Изотахофорез: белки  распределяются в соответствии  с их электрофоретической подвижностью  и мигрируют с одинаковой скоростью.

4. Электрофорез на  носителях , которые могут выступать  в роли простой поддерживающей  среды (стабилизатора) или обладать  свойствами молекулярного сита, имеющего дополнительный возможности  для улучшения разделения иакромолекул.

 

Основные этапы  электрофоретического анализа:

1. подготовка буферных растворов и других необходимых компонентов для проведения электрофореза;
2. подготовку носителя (в случае зонального электрофореза);
3. подготовку опытного образца, подлежащего разделению, и нанесение его нак носитель;
4. наблюдение за процессом электрофореза;
5. детектирование электрофоретических зон;
6. оценка результатов электрофореза.

Первые три этапа проведения электрофореза являются индивидуальными и имеют свои характерные особенности для каждого электрофоретического метода. три последних этапа являются общими для всех разновидностей электрофореза.

Наблюдение  за процессом электрофореза. В ходе электрофореза перемещение бесцветных растворимых макромолекул и образующихся из них фракций невидно. Для наблюдения за процессом электрофореза и определения момента его окончания в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые соединения, при этом краситель не должен взаимодействовать с ними. скорость миграции красителя должна превышать таковую наиболее подвижных макромолекул. В ходе электрофореза краситель передвигается в виде окрашенной зоны и когда она доходит до конца носителя, электрофорез прекращают.

Детектирование  электрофоретических зон. Разделившиеся фракции биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют, часто эту процедуру осуществляют с одновременным окрашиванием. Связывание макромолекул с окрашивающими веществами – это наиболее распространенный способ их выявления после электрофореза в таких поддерживающих средах, как бумага. полоски ацетата целлюлозы, гели. выбор красителя зависит от состава изучаемого препарата, природы поддерживающей среды и от метода разделения. Для окраски электрофореграмм белков наиболее часто применяют  амидиловый черный 10В, растворы нитрата серебра, кумасси ярко-синий (бриллиантовый голубой), бромфеноловый синий, азокармин В, универсальный краситель stains all.

 Носитель с определяемым  веществом погружают на определенное  время  в ванну или в пробирки  с раствором красителя, после чего избыток красителя, не связывшегося с разделенными фракциями макромолекул, удаляют.

Самый простой способ обесцвечивания фона состоит в вымачивании  поддерживающей среды в жидкости, хорошо растворяющей свободный краситель  и неспособной вызывать диссоциацию комплексов красителя с макромолекулами. Процесс обесцвечивания занимает немалое время и для его ускорения применяют частую смену растворителя, адсорбцию на активированном угле ил  электрофоретическое удаление несвязанного красителя.

Оценка результатов электрофореза. В зависимости от поставленных задач  результаты электрофореза оценивают разными способами:

-простое документирование(фотографирование  или зарисовка);

-определение величины  абсолютной или относительной  электрофоретической подвижности;

-денситометрия;

-определение характерных  химических, физических, физико-химических  и биологических показателей фракций.

 

Факторы, влияющие на подвижность  компонентов образца

Электрофоретическая подвижность  заряженных молекул зависит от нескольких факторов, к числу которых относятся величина заряда, размеры и форма молекул:

1. Заряд. Электрофоретическая подвижность молекул возрастает с увеличением их суммарного заряда. В свою очередь на величину заряда существенное влияние оказывает значение рН используемого буфера. Таким образом, изменяя величину рН можно влиять на подвижность макромолекул, обеспечивая их полное разделение.
2. Размеры. Чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность: это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с носителем по сравнению с молекулами меньших размеров.
3. Форма. Молекулы одинакового размера, но различной формы, например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разной подвижностью. Это обусловлено различиями в силе трения и различиями в электростатическом взаимодействии.