Получение лимонной кислоты

Испытаны также муравьиная кислота, кремнефтористый натрий, пентахлорфенолят натрия, но они одновременно снижают выход лимонной кислоты. Сульфамидные препараты не подавляют бактерий. Бактерицидные концентрации антибиотиков (млн. ед./м³): стрептомицин 40, биомицин 4, тетрамицин 2, полимиксин 1. Известны рекомендации по применению неомицина, низина, левомицетина, полимиксина, а при вспышке дрожжевой инфекции – леворина. Однако, обладая эффективным антимикробным действием и отсутствием отрицательного влияния на А. niger, антибиотики имеют тот недостаток, что они очень дороги.

Тепловая стерилизация мелассных  сред при указанной выше температуре  снижает качество их для биохимической переработки. С целью «смягчения» теплового режима целесообразно тепловую обработку проводить в присутствии антимикробных веществ. Снижение температуры без существенного изменения состава питательной среды может быть достигнуто также предварительной обработкой ферментным препаратом, расщепляющим стенки бактерий и спор. Во всех случаях, когда требуется сохранить термолабильные компоненты среды, стерилизацию ведут при более высокой температуре и соответственно меньшем времени, так как с повышением температуры скорость гибели микроорганизмов возрастает быстрее скорости разрушения этих компонентов.

 

Предложено применение и других методов стерилизации мелассы: различными видами лучистой энергии (УФ-лучи, γ-лучи, лазерное излучение), ультразвуком, импульсными электрическими разрядами, наложением электромагнитных полей сверхвысокой частоты, фильтрацией через антимикробные волокна и т.д., но они пока не нашли применения в производстве.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Продуцент лимонной кислоты

 

В настоящее время для ферментации сахарсодержащих сред используют специальные штаммы Aspergillus niger. Имеются патенты на применение других видов Aspergillus и других родов, принадлежащих к различным классам микроскопических грибов: A. wentii, A. lichinensis, A. clavatus, A. foetidus, A. awamori, A. carbonarius, A. glaucus, A. fumaricus, A. cinnamoneus, A. aureus, A. lanosus, A. melleus, A. ochraceus, A. gorakphurensis; Penicillium luteum, P. janthinellum, P. restricum, P. adamentzii, P. arenarium, P. olivaceum, P. divaricatum, P. sunguiflaus, P. glaucum; Mucor piriformis; Trichoderma viride; Botrytis sp.; Nematospora corily и др.

С производственной точки зрения A. niger и другие мицелиальные грибы  имеют существенные недостатки: медленно растут, вследствие чего процесс накопления необходимого количества биомассы продолжителен; большая вязкость культуральной жидкости, переходящая в неньютоновскую область, затрудняет массообмен, в частности снабжение гриба кислородом воздуха, увеличивает расход энергии на перемешивание. Перспективным является поиск и селекция немицелиальных микроорганизмов — дрожжей, бактерий, которые не имеют отмеченных недостатков. Это особенно желательно для перевода процесса ферментации на непрерывно-проточный.

При использовании любого вида сырья наряду с оптимальными составом питательной среды и режимом ферментации эффективность производства определяется применяемым штаммом A. niger. Штаммы для производства лимонной кислоты должны отвечать следующим основным требованиям: 1) давать возможно больший выход лимонной кислоты к массе введенного в производство сахара и быстро его ферментировать; 2) быть генетически однородными; 3) обладать устойчивостью к внешним воздействиям.

Выход лимонной кислоты зависит  от относительных затрат сахара на образование лимонной кислоты, побочных кислот, синтез биомассы гриба и дыхание, а также от полноты ассимиляции сахара. Очевидно, чем меньше остается сахара в культуральной жидкости в конце процесса ферментации и чем больше его идет на образование лимонной кислоты, при уменьшении других затрат, тем выше продуктивность штамма. Немаловажное значение имеет и повышение скорости ферментации.

Жизнедеятельность A. niger проявляется  в процессах питания, дыхания, роста  и в реакциях на внешние раздражения. Питание и дыхание, необходимые организму для синтеза клеточного вещества и получения энергии, являются основой метаболизма.

По типу питания аспергиллы относятся  к гетеротрофным организмам, усваивающим  углерод из органических соединений. В среде могут содержатся витамины (мкг/г): тиамин 150; рибофлавин 70—85; пантотеновая кислота 244—727; никотинамид 120—840; фолиевая кислота 210; цианкобаламин 178. Существует мнение, что присутствие витаминов в среде не обязательно, так как A. niger может синтезировать их сам. Все же присутствие некоторых из них в питательной среде желательно. Так, биотин необходим для нормального функционирования всех организмов. Добавление небольших количеств биотина в питательную среду стимулирует рост A. niger. Аналогичное действие оказывает добавление пантотеновой кислоты. Образование лимонной кислоты стимулируется тиамином.

 

5. Биохимическая схема

 

Биосинтез лимонной кислоты осуществляется с помощью культуры А. niger, специально селекционированной для получения высоких выходов продукта. В качестве углеродсодержащего субстрата используют мелассу, которая кроме углеводов, содержит большой ряд органических кислот. Применение определенной питательной среды с сахарозой приводит к меньшему качественному разнообразию кислот (лимонная, щавелевая и глюконовая кислота).

Биохимический механизм образования лимонной кислоты  основан на функционировании цикла трикарбоновых кислот. Дегидрирование уксусной кислоты приводит к образованию двух молекул СО₂ и четырех пар ионов водорода. В цикле происходит также образование НАДН и АТФ. Хотя большинство реакций цикла обратимы, основным направлением течения энзиматических реакций является образование щавелевоуксусной кислоты через α-кетоглутаровую, янтарную и фумаровую кислоты.

Реакцией, лимитирующей скорость оборота  цикла, является синтез лимонной кислоты, катализируемый аллостерическим ферментом цитратсинтетазой. Источником ацетил-КоА, который идет на синтез метаболитов цикла, является продукт цикла – лимонная кислота – легко переходящая в цитоплазму через мембрану. Как правило, из ЦТК на нужды биосинтеза уходит значительное количество метаболитов, и пополнения их фонда и функционирования полного цикла в клетках существуют дополнительные возмещающие ферментативные механизмы, например глиоксилатный шунт. В последнем, в отличие от ЦТК, уксусная кислота расходуется на синтез. Следовательно, первой реакцией ЦТК является конденсация ацетил-КоА со щавелевоуксусной кислотой, катализируемая цитратсинтетазой. Именно активность этого фермента является контролирующим параметром, определяющим скорость метаболического потока в цикле. Ингибирующий эффект на цитратсинтетазу оказывает НАДН и сукцинил-КоА. Но основное влияние на скорость синтеза лимонной кислоты оказывает поступление субстрата (щавелевоуксусной кислоты). Так как непрерывная «работа» ЦТК требует реокисления восстановленных эквивалентов (используются 4 пары дегидрогеназ), максимальная скорость цикла наблюдается в условиях достаточного доступа кислорода в клеточную систему (т.е. при хорошей аэрации).

Аэрация имеет критическое значение для глубинной ферментации. Пропускание чистого О₂ увеличивает образование лимонной кислоты, но это дорого; газовая фаза может циркулировать, если при этом поглощается СО₂. Прерывание аэрации на короткое время может иметь губительное действие на продукцию лимонной кислоты, но если при этом повысить рН с 3,0 до 4,0, то ферментация может начаться снова.

У грибов различают трофофазу, которая  характеризуется ростом мицелия  и активным дыханием с выделением СО₂, и идиофазу (продукционную фазу), когда рост завершен, дыхание подавлено, а оставшаяся глюкоза перерабатывается во вторичные метаболиты; в данном случае в лимонную или другие кислоты.

Образование лимонной кислоты может  быть условно разделено на три процесса: 1 – разложение гексоз до пирувата и ацетил-КоА при гликолизе, 2 – анаплеротическое образование оксалоацетата из пирувата и СО₂ и 3 – аккумуляция цитрата в ЦТК. А. niger разлагает глюкозу по гексозодифосфатному (80%) и гексозомонофосфатному пути.

При работе первого пути СО₂,образованная в результате декарбоксилирования пирувата, фиксируется при анаплеротическом образовании оксалоацетата. (При работе гексозомонофосфатного пути СО2 не фиксируется). Наряду с гликолизом у A. niger частично реализуется и другой путь окисления углеводов — пентозофосфатный, называемый также пентозным, гексозомонофосфатным, или фосфоглюконатным. Общим с гликолизом исходным продуктом является глюкозо-6-фосфат, но в дальнейшем их пути расходятся: фермент фосфофруктокиназа определяет дихотомический путь, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа — апотомический. Конечными продуктами процесса являются 3-фосфоглицериновый альдегид и рибозо-5-фосфат. Первый из них по реакциям гликолиза превращается в пировиноградную кислоту, поэтому пентозофосфатный цикл рассматривается как шунт гликолитического пути. Основное назначение цикла — снабжение клетки НАДН₂, необходимой для восстановительных реакций синтеза липидов и стероидов, и пентозами, в основном рибозой, используемой в синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Гексозомонофосфатный  путь и гликолиз имеют много общих ферментов. Таким образом, оба пути могут реализовываться в клетке одновременно. При превращении 6 молекул глюкозо-6-фосфата по гексозомонофосфатному пути суммарный эффект будет тот же, что и при окислении 1 молекулы гексозы в СО₂ по пути гликолиза и ЦТК.

В процессе разложения глюкозы образуются промежуточные соединения: манит, арабит, эритрит, глицерин.

Образование лимонной кислоты тесно связано со скоростью фиксации СО₂. Фиксацию СО₂ у А. niger осуществляет конститутивный фермент пируваткарбоксилаза. Существуют почти стехиометрическое отношение между фиксацией СО₂ и продукцией цитрата.

Фермент аконитаза, участвующий в расщеплении  цитрата в ЦТК, снижает его  продукцию. Считали, что при дефиците Fe или при добавлении Cu происходит ингибирование аконитазы и соответственно увеличение выхода цитрата. Однако аконитаза катализирует реакцию, сильно сдвинутую в сторону образования цитрата, и необходимости в ее ингибировании нет. Другой фермент – НАДФН-зависимая изоцитратдегидрогеназа, которая теоретически должна способствовать снижению аккумуляции лимонной кислоты, ингибируется цитратом. Правда, у А. niger имеется еще один аллостерически НАД-связанный фермент – изоцитратдегидрогеназа, которая активируется цитратом.

Выход лимонной кислоты зависит  от активности α-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование сукцинил-КоА из α-кетоглутарата под действием α-кетоглутаратдегидрогеназы называют узким местом ЦТК. Фермент ингибируется физиологической концентрацией щавелевоуксусной кислоты и НАДН. Увеличение клеточного оксалоацетата снижает катаболизм цитрата на уровне α-кетоглутарата и одновременно усиливает скорость его синтеза при участии цитратсинтазы. Аккумуляция α-кетоглутарата и НАДН снижает активность НАД(НАДФ)-изоцитратдегидогеназы, что способствует увеличению накопления цитрата до уровня, при котором сам ингибирует вышеуказанный фермент.

Цитрат сильно ингибирует транспорт  глюкозы в клетке путем подавления активности фосфофруктокеназы. Последнему противодействует увеличение концентрации NH₄⁺, а накоплению NH₄⁺ способствует дефицит Mn в среде. Полагают, что при дефиците Mn усиливается разложение белков и внутриклеточное содержание NH₄⁺ возрастает. Повышение концентрации аммонийных ионов внутри клеток смягчает ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокиназу.

Большинство исследователей склоняется к мнению, что основную роль играет ингибирование ферментов — аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы. Ингибирование аконитатгидратазы объясняют действием самой лимонной кислоты или избытка гексацианоферроата калия, применяемого для обработки мелассных сред перед ферментацией.

При интенсивном кислотообразовании активность цитратсинтетазы возрастает приблизительно в десять раз. Однако по имеющимся данным еще нельзя решить вопрос, что является причиной накопления лимонной кислоты — ингибирование указанных двух ферментов или активирование цитратсинтетазы.

Известно, что ко вторым суткам ферментации  в среде, уже покрытой тонкой мицелиальной пленкой, в ощутимых количествах содержатся янтарная и яблочная кислоты, а также не относящиеся к ЦТК кислоты: глюконовая, сахарная и малоновая. Первые две кислоты образуются непосредственным окислением глюкозы, малоновая как промежуточный продукт на пути синтеза насыщенных жирных кислот. Содержание этих кислот возрастает до третьих—пятых суток ферментации. Таким образом, ингибирование аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы начинают вызывать перечисленные выше кислоты, что вызывает постепенное накопление лимонной кислоты, которая в свою очередь еще больше ингибирует данные ферменты, и усиливает их синтез.

Следует обратить внимание еще на одного возможного участника в этом механизме — малоновую кислоту, являющуюся специфическим ингибитором  сукцинатдегидрогеназы. Малоновая  кислота образуется больше других кислот и содержание ее в среде возрастает до четвертых-пятых суток — времени начала наиболее интенсивного продуцирования лимонной кислоты.

В период интенсивного накопления лимонной кислоты в ЦТК преобладает  анаплеротический путь метаболизма, т.е. сначала происходит карбоксилирование пировиноградной кислоты с образованием щавелевоуксусной, а затем конденсация ее с ацетил-КоА. Интенсивность образования лимонной кислоты в этот период может быть понятна также из того, что в данном случае резко ограничиваются возможности конструктивного и энергетического обмена веществ клетки и A.niger для поддержания жизнеспособности вынужден перерабатывать значительно большее количество субстрата.

Фактором, стимулирующим аккумуляцию  лимонной кислоты, служит аэрация. О₂ необходим и для реокисления гликолитического НАДН в процессе лимоннокислой ферментации.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. Технологическая схема

 

Процесс производства лимонной кислоты  включает все основные стадии микробиологической технологии (рис. 6):

- получение посевного материала;

- подготовка сырья-мелассы к ферментации;

- подготовка и стерилизация воздуха;

- ферментация;

- отделение биомассы продуцента — мицелия;

- выделение из культурной жидкости лимонной кислоты и получение ее в кристаллическом виде.

В промышленном производстве лимонной кислоты применяется несколько  вариантов процесса.