Клиническая токсикология. Содержание предмета, задачи, понятие о ядах и отравлениях

Частные методы изолирования веществ кислотного характера

* изолирование барбитуратов  подщелоченной водой (метод П. Валова);

* метод Е. Грусц-Харди.

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой (метод П. Валова)

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой схематично можно представить следующим образом:

* Настаивание измельчённого  объекта с водой, подщелоченной 20% раствором натрия гидроксида до рН = 12 и более, в течение 30 мин.

* Очистка водного извлечения  путём насыщения натрия вольфраматом, фильтрование раствора.

* В кислой среде (серной  кислотой до рН=2), экстрагирование  эфиром, концентрирование эфирного извлечения упариванием.

Выход составляет 50% и даже до 90%, в зависимости от вида барбитурата. Метод даёт достаточно чистые извлечения, т.к. включает стадию очистки (осаждение белков натрия вольфраматом), что повышает качество последующего анализа.

Недостатком метода

Является соосаждение барбитуратов с белками при обработке натрия вольфраматом. В последней модификации метода серная кислота заменена на натрия гидросулъфат, что увеличивает выход искомых веществ.

Метод Е. Грусц-Харди - изолирование смесью спирта и хлороформа

Измельченный биологический материал растирают с сульфатом аммония, подкисляют раствором хлористоводородной кислоты до рН=2, экстрагируют смесью этилового спирта и хлороформа Экстракт отделяют, выпаривают, сухой остаток растворяют в горячей воде и фильтруют. Из фильтрата экстрагируют вещества кислотного характера эфиром. Частные методы изолирования веществ основного характера Частный метод изолирования алкалоидов водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф. Крамаренко)

Метод был разработан Львовской школой судебных химиков под руководством заведующего кафедрой аналитической и токсикологической химии Львовского медицинского института проф. В.Ф. Крамаренко. В 1956 - 62 г.г. целый ряд работ химиков этой школы был посвящен влиянию рН среды, природы экстрагента и присутствия в водной фазе электролита на эффективность изолирования алкалоидов из биоматериала Схематично метод можно представить из следующих этапов:

* Настаивание измельчённою  объекта с водой, подкисленной 20% раствором серной кислоты до рН =2- 3, в течение двух часов. Вода берётся в количестве 1 : 2 по отношению к навеске объекта Водное извлечение филыруется. Операция повторяется двукратно.

* Очистка водного извлечения  от белковых соединений путём  насыщения его аммония сульфатом, настаивания в течение часа и фильтрования образовавшегося осадка.

* Очистка фильтрата от  жиров, смол, пигментов путём экстракции  эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают.

* Подщелачивание водного  извлечения 20% раствором натрия гидроксида  и экстрагирование веществ основного характера хлороформом при рН =9-10 (трёхкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием.

Разработанный вначале для алкалоидов, метод применим и для изолирования других азотсодержащих веществ основного характера (синтетических лекарственных средств).

Метод достаточно быстрый. Преимуществом является хорошая очистка извлечений от соэкстрактивных веществ.

Кроме указанных выше методов изолирования, для отдельных алкалоидов, таких, как-жидкие алкалоиды - анабазин, никотин, кониин рекомендуется перегонка алкалоидов с водяным паром с последующим экстрагированием из дистиллята органическим растворителем. Для стрихнина и пахикарпина предложены такие методы, как электрофорез и электродиализ.

Исследование биологических жидкостей

1. При исследовании биожидкостей, таких как кровь, моча, плазма, слюна, сыворотка, промывные воды желудка, для изолирования «нелетучих»  ядов используют прямую дробную  жидкость - жидкостную экстракцию (ЖЖЭ).

Биожидкость подкисляют хлористоводородной кислотой до рН 2-3 и экстрагируют эфиром (фракция А), а затем подщелачивают до рН 9-10 и экстрагируют хлороформом (фракция Б). Во фракции А присутствуют вещества кислого, нейтрального и слабоосновного характера, во фракции Б - вещества основного характера.

ЖЖЭ соответствует второй стадии изолирования ядов из биоматериала в рассмотренных ранее общих методах, поэтому все факторы, определяющие эффективность изолирования на этой стадии, имеют место здесь.

Для некоторых веществ основного характера (морфин) при изолировании его из биожидкостей предварительно проводят кислотный гидролиз, чтобы разрушить его комплекс с глюкуроновой кислотой, в виде которого он находится в жидкостях. При прямой ЖЖЭ совместно с ядом из биожидкостей могут экстрагироваться сопутствующие вещества, что заставляет в дальнейшем прибегать к различным методам очистки.

В последнее время для изолирования ядов из биожидкостей применяется сорбция их на синтетических смолах, модифицированных силикагелях и активированном угле. Вещества сорбируются на твердом носителе, а потом элюируются из него органическим растворителем (по фракциям). Метод позволяет не проводить дополнительную обработку пробы и изолирование, дает возможность одновременно сконцентрировать вещество и провести очистку. Это приводит к повышению чувствительности метода. Однако, при неизвестном яде сорбция не всегда может быть использована ввиду опасности его потери из-за недостаточной сорбции.

Очистка изолируемых веществ от сопутствующих компонентов

При изолировании ядовитых веществ из биоматериала совместно с ними экстрагируются т.н. соэкстрактивные вещества - примеси белков, продуктов их гидролиза - пептидов и аминокислот, липидов и ряда других соединений, которые являются естественными компонентами биоматериала.

Соэкстрактивные вещества в дальнейшем мешают проведению анализа:

1. Маскируют окраску при  проведении реакций окрашивания (обугливание соэкстрактивных веществ  под действием концентрированной  серной кислоты).

2. Снижают чувствительность  микрокристаллических реакций и приводят к образованию кристаллов неправильной формы, либо к их полиморфизму (многообразие форм).

3. Искажают спектры веществ  при спектральном исследовании  в УФ- и ИК-областях.

4. Дают искаженные результаты  количественного определения веществ.

5. Многие продукты гнилостного  разложения биоматериала дают  такие же реакции, как и некоторые  ядовитые вещества (например, трупные  алкалоиды - путресцин, кадаверин - дают  реакции с общеалкалоидными реактивами).

Для получения надежных результатов необходима очистка исследуемых вещесгв от соэкстрактивных веществ биоматериала. Очистка может быть проведена при подготовке объекта, в процессе изолирования или после него.

На 1 этапе изолирования возможна только грубая очистка, которая проводитяс путем:

1 - удаления механических  загрязнений (мелких частиц биоматериала) фильтрованием, центрифугированием;

2 - осаждения примесей  при добавлении соответствующих  реагентов, например, осаждение белков абсолютным спиртом, ацетоном, трихлоруксусной кислотой, вольфрамовой, фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой кислотами, насыщение электролитами (Na2S04, (NHUfeSCi, NaCl). При этом возможно соосаждение искомых веществ, что ведет к их частичной потере;

3 - изменения состава фаз, т.е. введения другого органического  растворителя (связано с большими  потерями веществ).

На 2 этапе изолирования или после него возможна более тонкая очистка, которая может осуществляться путем:

1 - реэкстракции, т.е. переведения веществ из одной жидкой фазы в другую при изменении рН раствора (например, очистка барбитуратов и алкалоидов за счет различной растворимости их солеобразных и молекулярных форм в воде и органических растворителях). При этом примеси отделяются от экстрагируемого вещества за счет нерастворимости в используемом экстрагенте. Либо, наоборот, экстрагирование примесей из раствора подходящим экстрагентом (эфир в методе В.Ф. Крамаренко).

2 - сублимации - для веществ, способных возгоняться без разложения при нагревании (салициловая, бензойная кислоты, барбитураты, жидкие алкалоиды).

3 - хроматографии - ионообменной, гель-хроматографии, адсорбционной  хроматографии на колонках, тонкослойной  хроматографии. Последний вид хроматографии  используется часто, т.к. наряду с очисткой дает возможность разделить вещества (их метаболиты) при комбинированных отравлениях и провести их предварительную идентификацию по величинам Rf (хроматографический скрининг «нелетучих» ядов.

6. Составить примерный план анализа при подозрении на отравление производными барбитуровой кислоты (фенобарбитал, барбитал, этаминал)

В современной медицине применяется большое число барбитуратов (производных барбитуровой кислоты). Барбитураты представляют собой одну из групп веществ, имеющих большое токсикологическое значение. Сама барбитуровая кислота (малонилмочевина) не применяется в медицине, зато широко используются ее производные.

Барбитуровая кислота со щелочами образует соли. Кислотные свойства барбитуровой кислоты обусловлены наличием атомов водорода в -- NH-группах, находящихся рядом с карбонильной группой --СО--.

Применяемые в медицине барбитураты являются 5,5-замещен-ными (барбамил, барбитал, фенобарбитал и др.) и 1,5,5-замещен-ными (гексенал, гексабарбитал, бензонал и др.) барбитуровой кислоты.

Выделение барбитуратов из биологического материала

Для выделения барбитуратов из биологического материала долгое время применялись методы, которые были разработаны для выделения алкалоидов. В последние десятилетия для выделения барбитуратов из объектов биологического происхождения предложен ряд специальных методов, которые описаны ниже.

Изолирование барбитуратов водой, подкисленной щавелевой кислотой. Оптимальные условия изолирования барбитуратов из биологического материала водой, подкисленной щавелевой кислотой, и способ очистки полученных вытяжек разработала М. Д. Швайкова с сотрудниками. Согласно этому методу, в коническую колбу или стакан вносят 100 г тщательно измельченных органов трупов, прибавляют 200 мл воды, подкисляют насыщенным водным раствором щавелевой кислоты до рН = 2 (по универсальному индикатору) и оставляют на 2 ч при частом перемешивании. Затем содержимое колбы переносят в стакан для центрифугирования вместимостью 500 мл и центрифугируют в течение 30 мин (3000 об/мин). Центрифугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку и проверяют рН этой жидкости. В случае необходимости жидкость доводят до рН = 2. Содержимое делительной воронки взбалтывают с тремя порциями хлороформа (по 20, 15 и 15 мл) в течение 5 мин. Если образуется эмульсия, то ее разрушают центрифугированием.

Хлороформные вытяжки соединяют, доводят хлороформом до 50 мл и переносят в делительную воронку, в которую прибавляют 25 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия, и взбалтывают. Водную фазу отделяют от хлороформной вытяжки. Эту вытяжку взбалтывают с двумя порциями воды по 1,5 мл. Первую и вторую порции воды (по 1,5 мл), которыми промывали хлороформные вытяжки, присоединяют к щелочной водной фазе. Потом водную фазу подкисляют соляной кислотой до рН = 2, вносят в делительную воронку и взбалтывают с двумя новыми порциями хлороформа (по 20 мл) в течение 5 мин. Хлороформные вытяжки соединяют и доводят хлороформом до 50 мл. В этих вытяжках определяют наличие и количественное содержание барбитуратов.

Изолирование барбитуратов водой, подкисленной серной кислотой. Метод выделения барбитуратов из биологического материала, основанный на изолировании этих веществ водой, подкисленной серной кислотой, разработала В. И. Попова. Согласно этому методу, биологический материал настаивают с водой, подкисленной серной кислотой (рН = 2...3). Полученные вытяжки освобождают от примесей методом гель-хроматографии. Для этой цели используется гель сефадекса G = 25.

В стакан вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 80 мл 0,02 н. раствора серной кислоты, перемешивают и проверяют рН среды. При необходимости смесь доводят до рН = 2...3 (по универсальному индикатору) 30 %-м раствором серной кислоты. Смесь биологического материала и подкисленной воды настаивают в течение 2 ч при частом перемешивании. Затем вытяжку сливают, а биологический материал еще 2 раза настаивают с новыми порциями 0,02 н. раствора серной кислоты (по 80 мл) в течение 1 ч. Кислые водные вытяжки соединяют, процеживают через сложенную в три слоя марлю и центрифугируют в течение 25--30 мин.

Надосадочную жидкость (центрифугат) сливают с осадка и очищают от примесей методом гель-хроматографии. Этот метод обеспечивает хорошую очистку барбитуратов, выделенных из биологического материала.

После очистки вытяжек из биологического материала с помощью метода гель-хроматографии получают большие объемы элюатов, в одном миллилитре которых содержатся малые количества барбитуратов. Поэтому барбитураты, находящиеся в элюатах, подвергают экстракционному концентрированию. С этой целью объединенные кислые элюаты 3 раза взбалтывают с новыми порциями хлороформа (по 50 мл) в течение 7 мин. Хлороформные вытяжки, полученные после каждой экстракции, соединяют и на водяной бане при 70 °С отгоняют из них 120--130 мл хлороформа. Оставшуюся упаренную хлороформную вытяжку при комнатной температуре выпаривают досуха. Сухие остатки используют для идентификации и количественного определения барбитуратов при помощи соответствующих реакций и методов.

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой. Подщелоченную воду для изолирования барбитуратов из биологического материала впервые применил П. Валов. Для осаждения примесей, переходящих из биологического материала в вытяжки, он использовал вольфрамат натрия. В настоящее время известно несколько модификаций метода Валова. Одна из модификаций метода Валова, предложенная М. Д. Швайковой с сотрудниками, приводится ниже.

В стакан или в коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 180 мл воды и 20 мл 10 %-го раствора гидроксида натрия. Содержимое стакана (или колбы) оставляют на 30 мин при частом перемешивании, а затем центрифугируют в течение 30 мин (3000 об/мин). От осадка отделяют надосадочную жидкость (центрифугат), к которой прибавляют 120 мл 10 %-го раствора вольфрамата натрия и 1 н. раствор серной кислоты (до pH = 2). Жидкость нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, а затем подвергают центрифугированию (30 мин). Центрифугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон, смоченный водой. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку. Тампон промывают водой (10 мл). Промывную воду тоже выливают в делительную воронку. К процеженной жидкости прибавляют равный объем диэтилового эфира и взбалтывают в течение 15 мин. Эфирный слой отделяют и взбалтывают с 50 мл 10 %-го раствора гидроксида натрия. Щелочной водный слой отделяют, подкисляют 25 %-м раствором серной кислоты до рН = 2 и взбалтывают с равным объемом диэтилового эфира. Полученную при этом эфирную вытяжку используют для обнаружения и количественного определения барбитуратов.