Антоцианы

Фуруйя Мазаки, Тиман Кеннеф [61] при изучении биогенеза антоцианинов извлекали их из тканей Spirodela oligorthiza и S. polyrrhiza с помощью 0,1 и соляной кислоты и концентрацию пигмента определяли фотометрически при 540нм. Кроме того, флавоноиды экстрагировали из 300мг свежих тканей метанолом при 80°, экстракт выпаривали, сухой остаток растворяли в воде и водный раствор разделяли хроматографией на бумаге в смеси растворителей м-бутанол-уксусная кислота - вода (4:1:2,2) и в 15%-ной уксусной кислоте. Пятна флавонондов просматривали в ультрафиолетовом свете, вырезали и элюировали 3час. 50%-ным водным раствором метанола и проводили идентификацию красящих веществ.

Нордстремом [62] разработан микрометод идентификации антоцианов путем сравнения значений Rf и ультрафиолетовых спектров (λnax=533-545нм) антоцианов с синтетическими стандартами в тех же условиях.

Линдстедт [63] провел электрофорез пигментов красной свеклы. При электрофорезе на бумаге (0,1-молярный цитратный буфер рН 5,5) получено хорошее разделение пигментов красной свеклы на 7 компонентов. Главный компонент с желтой окраской легко разрушается и обнаруживается лишь в свежем соке. При рН меньше 2 наблюдается слабая тенденция пигментов красной свеклы двигаться к катоду, тогда как обычные антоциановые пигменты обладают положительным зарядом. В их молекулах преобладают карбоксильные группы. Красный пигмент сока сахарной свеклы прочно адсорбируется на анионообменных смолах и гораздо слабее на катионах. Антоцианы из плодов и ягод обладают по отношению к ионитам обратными свойствами. Для разделения пигментов красной свеклы автор применял также колонки с целлюлозой (буфер 0,1-молярная муравьиная кислота и 0,1-молярный пиридин в различных отношениях при рН 3,5).

Драверт [64] провел выделение и идентификацию антоцианов в красных суслах и винах, особенно антоцианов гибридов, посредством хроматографии на бумаге. 100мл вина смешивают с 50мл водного раствора уксуснокислого свинца. Осадок отделяют центрифугированием в течение 5мин. при 5000об/мин. К осадку, окрашенному в голубые тона различной интенсивности, прибавляют 4н. соляную кислоту, затем окончательно титруют 2н. соляной кислотой до появления красной окраски и вспенивания раствора; обычно затрачивается 6-14мл соляной кислоты, конечное значение рН 1,6-1,9. Интенсивно красный раствор фильтруют через складчатый фильтр и фильтрат хроматографи­руют. Растворитель н-пропанол - н-бутанол - 5%-ный водный раствор борной кислоты (1:1:1). На бумаге Binzer 208 разгонка 20час; на бумаге S и S 2043-b разгонка 6-10 час. В ультра­фиолетовом свете проявляются флуоресцирующие антоцианы, которые наблюдаются в сортах Riparia с Rf 0,22 до Rf 0,6.

Ренчлером [65] описан метод открытия диглюкозида мальвидина антоциана, характерного для синих сортов гибридного винограда и получаемых из них вин. Напитки, богатые красящими веществами, подвергают хроматографическому анализу на бумаге без предварительной подготовки, а из слабоокрашенных напитков красящие вещества адсорбируют активированным углем, затем извлекают из него антоцианы спиртовым раствором муравьиной кислоты. При этом увеличивается концентрация красящих веществ и происходит очистка их от примесей. Мальвидин обладает красной флуоресценцией в ультрафиолетовом свете.

Таннер, Ренчлер [66] предложили дополнение к разработанной ими методике определения красящих веществ гибридных виноградных соков и вин.

Методика А. Сильноокрашенные вина, не содержащие сахара, хроматографируют без предварительной обработки. 100мл вина наносят на бумагу порциями по 20мл и подсушивают током холодного воздуха, затем хроматографируют.

Методика В красные вина и красные виноградные соки с окраской средней интенсивности и вина, содержащие сахар, бе­рут в количестве 50мл, смешивают с 1г активированного угля, нагревают до кипения, фильтруют через стеклянный фильтр G5-G3 и промывают 20мл дистиллированной воды. Фильтрат отбрасывают, элюцию с угля проводят 100мл подогретого до 50° раствора, состоящего из 1 части концентрированной аммиачной воды и 4 частей 90%-ного алкоголя. Элюат выпаривают в вакууме при 50° до 2-3мл. Зелено-голубой раствор подкисляют по каплям концентрированной фосфорной кислотой до появления красной окраски. Далее поступают, как в случае А. Вина и соки, бедные красящими веществами, берут в количестве 130мл и обрабатывают по прописи В.

Теми же авторами описан метод определения примесей гибридных вин к европейским. Красящие вещества вина очищают от примесей пектинов добавлением хлористого кальция, концентрируют и хроматографируют. Растворитель содержит в 1000мл 3,92г фосфорной кислоты (d= 1,71), 2,40г уксусной кислоты и 2,48г борной кислоты, рН растворителя 1,81. Хроматограмму просматривают в ультрафиолетовых лучах. Красящее вещество гибридных вин в отличие от европейских флуоресцирует ярко-красным светом.

Д. Цаков, Г. Гетов [67] провели сравнение существующих методов определения интенсивности окраски и красящих веществ в красных винах. При этом было установлено, что метод Вобиша и Шпайдера при эталоне сульфат кобальта (50г на 1л) более точен, чем метод Рооса. Наилучшие результаты дает фотометрический метод Дурмишидзе и хроматографический метод Вильямса и Тарановой [68]. Результаты, полученные по методу Дурмишидзе, необходимо умножить на переводной коэффициент 1,5.

Фрэнсисом [69] предложено определять количество пигмента в ягодах свежей клюквы следующим путем. 50г ягод гомогенизируют с 200мл смеси 95%-ный этанол - 0,1 н. соляная кислота (4:1 по объему). Операцию повторяют со свежей порцией растворителя. Прозрачный раствор разбавляют (обычно в пропорции 1:25) и через 30 мин. спектрофотометрически определяют поглощение при 500нм, используя в качестве стандарта раствор конго красного. Содержание пигмента рассчитывают по формуле:

мг конго красного = 2,13×оптич. плотность× разбавление

    г свежих ягод

Антоцианы являются сильными антиоксидантами, нейтрализуют действие свободных радикалов, подавляют рост опухолей, благотворно действуют на организм человека.

Эти антиоксиданты сохраняют свои свойства при употреблении растений другим организмом. Поэтому овощи и фрукты ярких цветов считаются полезными для организма. Добавка Е163, в силу природных свойств антоцианов, способствуют уменьшению ломкости капилляров, улучшает состояние соединительных тканей, помогает предотвратить и лечить катаракту и в целом оказывает благоприятное воздействие на весь организм.

Сейчас во всем мире ведется множество исследований по изучению действия антоцианов. Так, например, недавние исследования в США показали что употребление антоцианов в пищу помогает сократить риск заражения раком пищевода и прямой кишки. Другие исследования говорят что антоцианы способствуют снижению воспалительных процессов в организме.

1.6. Определение антиоксидантной активности

Антиоксидантное действие большинства биологически активных соединений связано с их способностью легко окисляться, отдавая электрон или атом водорода, что положено в основу определения индивидуальных восстановителей по их воздействию на окислительно-восстановительную систему, содержащую комплексные соединения ионов переходных металлов: Fe(III) – 2, 2′ дипиридил, Fe(III) – трипиридил-триазин, Fe(III) – ферроцин, Cu(II) – неокупроин, Ru – 2, 2′ дипиридил.

Анализ литературных данных показал, что существующие в настоящее время методы определения антиоксидантной активности в большинстве случаев основаны на способности антиоксидантов взаимодействовать со свободными радикалами. Для оценки антиоксидантной активности индивидуальных веществ и реальных объектов обычно используют радикалы, образующиеся в процессе окисления липидсодержащих субстратов либо генерируемые в различных системах (Fe(III) – H2O2, гипоксантин – ксантиноксидаза, пероксидаза хрена – H2O2) радикалы OH˙, O˙ֿ2. [70]

Методы, основанные на ингибировании антиоксидантами окисления липидов[71], дают более достоверные результаты, поскольку характеризуют способность исследуемого объекта подавлять свободнорадикальные окислительные процессы в организме. Однако данные методы являются длительными и трудоемкими, а полученные результаты плохо воспроизводимы и зависят от многих параметров: природы окисляемого субстрата, концентрации инициатора, начальной скорости окисления.

Антиоксидантная активность обусловлена числом и расположением функциональных групп, способных легко отдавать атом водорода (–OH, –SH, –NH), наличием сопряженных двойных связей, а также пространственной структурой молекул. Так, кверцетин, который имеет две 3' и 4' гидроксильные группы в орто-положении кольца В и одну в 3 положении кольца С является более эффективным антиоксидантом, чем его гликозид рутин, активная 3 – OH группа которого замещена сахарным остатком (рутинозой). Кроме того, наличие гликозидного остатка приводит к изменению пространственного расположения молекулы, что также является причиной более низкой антиоксидантной способности гликозидов по сравнению с агликонами. Различие в восстановительной способности цистеина и трипептида глутатиона, по-видимому, также обусловлено пространственной структурой их молекул.

Метод хроматографии на колонке или фильтре является промышленно осуществимым в отличие от метода хроматографии на бумаге или ТСХ. Существенным отличительным признаком нового способа являются условия проведения этапа хроматографии.

Обогащенный таким способом антоциановый комплекс содержит 83-89 вес.% антоцианов. Далее для выделения из комплекса индивидуальных компонентов проводят колоночную хроматографию на колонке или фильтре, заполненными силикагелем с размером частиц 0.040-0.063мм, например, выпускаемом фирмой Merck. Выбор данного сорбента объясняется как его высокими хроматографическими свойствами, так и экономичностью использования за счет возможности его эффективной регенерации. Процесс проводят под вакуумом - так называемой флэш-хроматографией, предпочтительно при 10-14 мм рт. ст., что позволяет достигать оптимального разделения. При этом вакуум подается от водоструйного насоса, обеспечивающего остаточное давление на указанном выше уровне. Существенной характеристикой нового метода, которая в комплексе с другими принципами способа обеспечивает высокую эффективность процесса, является применение экспериментально подобранной хроматографической системы этилацетат/уксусная кислота/вода в соотношении 0.67-4.67/1/1. Использование метода элюции антоцианов данной хроматографической системой с различным соотношением компонентов на силикагеле позволяет достигнуть качественного разделения компонентов смеси антоцианов.

Таким образом, проанализированные данные литературы показывают, что антоцианы обладают многими полезными свойствами, в том числе высокой антиоксидантной активностью. Они имеют широкое применение в пищевой, текстильной и фармацевтической промышленности. Но ввиду того, что они являются крайне неустойчивыми, зависят от рН, температуры и условий хранения продуктов, проблема изучения природных антоцианов и стабилиза ции их структур, синтез аналогов остаётся актуальной и в наше время.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Получение и идентификация антоциановых красителей

10г измельчённого сырья залили 150мл этилового спирта (70%), подкисленного HCl (1%). Настойку на сутки при комнатной температуре. После этого экстракт отфильтровали на фарфоровой воронке.

2.1.           Водно-спиртовая экстракция с дальнейшей сорбцией на тальке

1.          

Водно-спиртовой экстракт упарили до объёма 40мл, доводили дистиллированной водой до 60мл, вливали в стакан объёмом 250мл. К раствору присыпали 50г талька, смесь суспензировали, переносили на воронку Бюхнера и фильтровали под вакуумом водоструйного насоса. Танин, частично адсорбирующийся на тальке, элюировали 500мл дистиллированной воды. Антоцианы элюировали с талька 200мл 80%раствора спирта, содержащего 1% HCl.

2.1.1.     Очистка в двухфазной системе

Этилацетат – вода

10мл водного экстракта (полученного по методике 2.1.) смешали с 10мл этилацетата. В результате образовалась двухфазная система жидкостей. Смесь разделили на делительной воронке. Верхний слой жидкости, где присутствовал этилацетат, выпарили до сухого состояния.

Изоамиловый спирт – гексан

10мл водного экстракта (полученного по методике 2.1.) смешали с 8,5мл изоамилового спирта и 1,5мл гексана. В результате образовалась двухфазная система жидкостей. Смесь разделили на делительной воронке. Верхний слой, где присутствовали изоамиловый спирт и гексан, выпарили до сухого состояния.

2.1.2.    Разделение колоночной хроматографией

При колоночной хроматографии в качестве адсорбентов использовали силикагель, тальк и окись алюминия, а в качестве растворителей и элюентов вода, этанол (70%) -1% соляная кислота, этанол (30%) – 1% соляная кислота, ацетон.

На колонку 250*25мм, заполненную сорбентом, объёмом 60мл, наносили 20 мл водный экстракт антоцианов (полученного по методике 2.1.). В первый раз в колонку залили 20мл холодной воды для промывки. Далее для получения первой фракции залили 30%-й этанол, подкисленный соляной кислотой, для получения 2 фракции залили 70% этанол, подкисленный соляной кислотой. Затем повели окончательную помывку сорбента ацетоном.

2.1.3.    Синтетический метод получения антоцианов конверсией из рутина и кверцетина

Получение амальгамы цинка

Нагревают (строго под тягой) до 90-100°С при перемешивании 2г гранулированного цинка с 35г металлической ртути и 3-5мл 5%-ной H2SO4. Масса сначала приобретает сероватый цвет и затем слегка густеет. Далее реакционную массу охлаждают льдом и промывают дистиллятом. Кристаллизовавшиеся темные куски сплава и солей удаляют, а амальгаму, содержащую 1,5 – 2 % Zn, после промывки хранят под слоем дистиллированной воды.

Конверсия кверцетина и рутина в антоцианы

Конверсию кверцетина в антоцианы проводили в абсолютированном этаноле в присутствии 5% соляной кислоты HCl. В качестве катализатора использовалась амальгама цинка ZnHg.

В реакционную колбу погрузили 0,5г кверцетина, затем залили 19,5мл этилового спирта EtOH и 0,5мл соляной кислоты. Затем осторожно добавили 0,5г амальгамы цинка. Реакционную смесь нагревали в течение 10 минут, с обратным холодильником на водяной бане, пока она не поменяла окраску с оранжевого цвета на темно-красную.

Полученный раствор охладили до выпадения осадка, отфильтровали. С полученным осадком провели повторную реакцию в пересчёте на его массу. Операцию повторяли до тех пор, пока в полученном растворе не переставал выпадать осадок.