Амилолитические ферменты зерна

Амилолитические ферменты

Биологическое значение амилаз при созревании и прорастании  семян растений исключительно велико. Вместе с тем ряд технологических  процессов пищевых производств  имеет в своей основе гидролитические  превращения крахмала под влиянием амилаз зерна.

Изучению свойств амилаз и условий  их воздействия на крахмал посвящено  большое количество исследований, обобщенных в обзорах и монографиях.

В зерне злаковых культур содержатся два специфических фермента, обусловливающих  гидролиз крахмала, а именно:

1. α-1,4-глюкангидролаза (3.2.1.1) или α-амилаза, гидролизующая α-1,4-глюкановые связи крахмала и родственных ему полисахаридов, причем эти связи разрываются беспорядочно. При этом происходит снижение вязкости клейстеризованного крахмала, образование низкополимеризованных декстринов, не дающих окраску с йодом, а также небольшое количество мальтозы. Тривиальное название этого фермента – декстриногенамилаза.

2. α-1,4-глюканмальтогидролаза или  β-амилаза, гидролизующая α-1,4-глюкановые  связи в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей. При действии её на крахмал образуется путем инверсии β-мальтоза. Тривиальное название этого фермента – сахарогенамилаза. β-амилаза в противоположность α-амилазе не действует на зерна нативного крахмала и слабо разжижает и декстринирует клейстеризованный крахмал. Осахаривание его происходит быстро, но прекращается при образовании около 60% мальтозы и 40 % предельного декстрина.

Свойства β-амилазы

β-амилаза растворима в воде и солевых растворах, но при кратковременной экстракции растворяется не весь фермент – значительная его часть находится в связанном состоянии и может быть извлечена только при продолжительном автолизе водно-мучной суспензии или воздействия протеаз. По мере автолиза все большее количество β-амилазы переходит в свободное состояние. Соотношение свободной и связанной β-амилазы подвержено значительным колебаниям. По ранним данным (Опарин и Каден, 1945), около 2/3 всей β-амилазы пшеницы находится в связанном (латентном) состоянии.

В исследованиях биохимии пшеницы Казахстана было показано, что количество связанной β-амилазы  может достигать до 80% е общего количества. Для перевода ее в активное состояние требуется 24-часовое переваривание  мучной суспензии папаином (табл. 1). Но как в отношении суммарной активности, так и в соотношениях свободной и связанной β-амилазы отмечены довольно широкие пределы колебаний, обусловленные, вероятно, состоянием зерна. Было показано (Hlynka, 1964), что в зерне пшеницы ранней молочной спелости вся β-амилаза переходит в раствор, но по мере созревания все большая часть фермента становится нерастворимой и требуется продолжительный автолиз или обработка протеазами для её извлечения (табл. 2). Повышается количество β-амилазы, переходящей в раствор и при воздействии веществ, восстанавливающих дисульфидные связи белка. Это заставило предположить, что между ферментом и глютенином имеются дисульфидные мостики, разрушение которых переводит β-амилазу в активное состояние (Rousell and Goad, 1962).

Таблица 1

β-амилаза пшеницы  получена в кристаллическом виде и хорошо изучена. При осаждении из растворов она образует правильные, несколько удлиненные сферические тела, отличающиеся от обычных белковых кристаллов. После предварительной очистки осаждение сульфатом аммония β-амилазу можно фракционировать на колонке ДЭАЭ-целлюлозе на три основных и два дополнительных компонента, содержащих активный фермент. При добавлении к солевому раствору глютатиона содержание β-амилазы в растворе значительно повышается, но при этом глютатион не влияет на распределение  компонентов при хроматографировании (Tkachuk and Tipples, 1996). Вероятно, при обработке глютатионом происходит освобождение связанной с белком амилазы.

Таблица 2

Получаемые при хроматографировании на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой три фракции β-амилазы значительно отличаются от другой величиной оптимального pH, а также своей активностью (табл.3). Установлен также аминокислотный состав этих фракций. Обработка раствора фермента KJO₃ не влияла на его активность и не изменяла константу седиментации при ультрацентрифугировании. Последнее указывает на то, что под действием окислителя либо не образовались новые дисульфидные связи между макромолекулами, либо они образовывались внутри молекул. Добавление к ферментному раствору веществ, связывающих сульфгидрильные группы (J-ацетат или N-этилмалеимид) также не оказывало влияния на активность фермента. Полное ингибирование β-амилазы отмечалось только при обработке ее раствора солями ртути.

Таблица 3