Фотохимические превращения ДНК. Люминесцентные метки и зонды и их применение в медицине.

В работе исследовались спектры УФ поглощения, люминесценции и её возбуждения для исходных состояний содержащих тиминовые хромофоры систем (водные растворы тимина; два типа кристаллов тимина - безводный и кристаллогидрат, и полученные из них слои; водные растворы политимидиловой кислоты (poly-T)), а также кинетика их изменения в результате фотопроцессов, вызываемых УФ облучением. По кинетике спада люминесценции твёрдых слоев тимина под действием УФ облучения определялись квантовые выходы фотодимеризации. Регистрация спектров люминесценции, её возбуждения, а также - поглощения (по однолучевой схеме) проводились с использованием спектрофлуориметра "Хита-чи-850" (с автоматической коррекцией спектров).

В результате проведённых исследований удалось получить ряд новых результатов:

1) Впервые показано, что  противоречия в литературных  данных по спектрам люминесценции  и её возбуждения водных растворов  тимина при комнатной температуре  связаны с накоплением в образцах  при люминесцентных измерениях  фотопродуктов с относительно  высокими квантовыми выходами люминесценции (фотоаддуктов).

2) Впервые проведено исследование  спектров люминесценции двух  типов кристаллов тимина (безводного  и кристаллогидрата), а также спектров  поглощения, люминесценции и её  возбуждения полученных из них  слоев на кварце. Для слоёв  кристаллогидрата обнаружены фракции  с экситонным расщеплением спектров  поглощения -4000 см"1 и относительно  высокой фотохимической активностью. Для двух типов слоёв впервые  определены квантовые выходы  фотодимеризации тимина.

3) Подробно исследованы  спектры люминесценции и впервые  исследованы спектры её возбуждения  водных растворов политимидиловой  кислоты при комнатной температуре. Выявлены две не описанные  ранее полосы люминесценции, отнесённые  к невзаимодействующим хромофорам и большим агрегатам. Впервые получены поэтапные разностные спектры поглощения водных растворов политимидиловой кислоты в процессе их УФ облучения и показано, что их фотохимическая активность в значительной мере обязана двум типам стопочных димеров с плотной упаковкой и экситонным расщеплением спектров поглощения -4000 см"1.

4) Впервые исследована  многократная воспроизводимость  обратимой фотодимеризации в  водных растворах политимидиловой  кислоты при комнатной температуре  с целью оценки её применимости  для записи информации и показано, что неполнота обратимости 6 фотодимеризации  обязана побочным фотохимическим  реакциям: образованию фотоаддуктов  и фототримеров.

Возвращаясь к ранее высказанному тезису о принципиальной возможности использования обратимой циклобутановой димеризации для записи информации, на основании полученных данных можно сделать выводы о практической осуществимости этой идеи. Как показывают литературные и полученные нами данные, обратимость циклобутановой димеризации, а соответственно - её применимость для записи информации, ограничивается параллельным ей накоплением фотоаддуктов. Поиск путей с одной стороны - повышения квантовых выходов циклобутановой фотодимеризации, а с другой стороны - ингибирования побочной по отношению к ней фотохимии, должен стать целью дальнейших исследований.

Основные результаты работы

1) Показано, что водные  растворы тимина люминесцентно  гомогенны - спектры их люминесценции имеют л4Пах=330 нм, а спектры её возбуждения с лтах=266 нм совпадают со спектрами поглощения. Противоречия в литературных данных по их люминесценции объяснены фотохимическими реакциями, ведущими к накоплению в образцах в процессе измерения относительно хорошо люминесцирующих примесей (фотоаддуктов).

2) Впервые исследованы  спектры люминесценции различных  кристаллических форм тимина (безводного  и кристаллогирата), а также спектры  люминесценции и её возбуждения  полученных из них слоев. В  полученных из кристаллогидрата  тимина слоях обнаружены спектральные  проявления существования парных  агрегатов с экситоннымрасщеплением спектров поглощения -4000 см"1 и относительно высокими квантовыми выходами фотодимеризации.

3) Определён квантовый выход циклобутановой димеризации тимина для слоев, полученных из его безводных кристаллов равный 0,07, а из кристаллогидрата - 0,10.

4) В водных растворах политимидиловой кислоты, по динамике изменения спектров поглощения под действием ультрафиолетового облучения, выявлено: а) два типа фотохимически активных парных агрегатов - первого, с полосами поглощения у 260 и 290-295 нм (с экситонным расщеплением -4000см"1), и второго, с полосами поглощения у 250 и 280-285 нм (экситонное расщепление -4300 см"1); б) относительно инертная фотохимически фракция изолированных тиминовых хромофоров с максимумом полосы поглощения у 270 нм.

5) В спектрах люминесценции  водных растворов политимидиловой  кислоты наблюдались полосы с  максимумами у 320, 340 и 350-355 нм (две  из них, 320 и 350-355 нм - впервые), которым  сопоставлены: а) первой - изолированные  тиминовые хромофоры с максимумом  поглощения у 270 нм; б) второй - парные  агрегаты первого и второго  типа, выявленные нами по динамике  изменения форм спектров поглощения  под действием УФ облучения; в) третьей - фотохимически инертные  агрегаты, состоящие из относительно  большого количества хромофоров, с выявленными по спектрам  возбуждения люминесценции полосами  поглощения у 240-245 и 305 нм (экситонное  расщепление -8000 см"!).

6) В твёрдых слоях тимина  и в водных растворах политимидиловой  кислоты параллельно циклобутановой фотодимеризации по динамике изменения спектров поглощения и люминесценции наблюдалось образование фотоаддуктов и реакция обратимой фототримери-зации тимина, ограничивающие обратимость циклобутановойфотодимеризации. По падению при облучении полосы люминесценции фотоаддуктов определены квантовые выходы фототримеризации в твёрдых слоях тимина (от 0,01 до 0,04 - в зависимости от состояния слоя) и водных растворах политимидиловой кислоты (-0,01).

7) В твёрдых слоях тимина  и в водных растворах политимидиловой  кислоты люминесцентными методами  наблюдался перенос энергии между  разными фракциями тиминовых  хромофоров и с тиминовых хромофоров  на образующиеся в процессе  облучения фотоаддук-гы.

Люминесцентная микроскопия

       Люминесцентная микроскопия — оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нему.

       Флюорохромы, как правило, флюоресцируют по-разному в зависимости от химического состава структур, с которыми они взаимодействуют. Некоторые из них обладают сродством к определенным клеточным структурам. Например, акридиновый оранжевый краситель окрашивает нуклеопротеиды клетки, аурамин — воскоподобное вещество, содержащееся в микобактериях. Некоторые микрообъекты не требуют предварительной окраски флюорохромами и изучаются с помощью люминесцентной микроскопии без окраски.

       Люминесцентная микроскопия (флюоресцентная микроскопия) — специальный вид микроскопирования, основанный на использовании собственной (первичной) или наведенной (вторичной) фотолюминесценции микроскопических объектов. Видимая люминесценция препарата возбуждается либо сине-фиолетовым светом, либо ультрафиолетовыми лучами. 
Люминесцентный микроскоп в принципе — обычный биологический микроскоп, снабженный двумя светофильтрами: один пропускает только возбуждающие сине- или ультрафиолетовые лучи (его помещают перед источником света), другой поглощает эти лучи и пропускает только более длинноволновый свет люминесценции препарата (его устанавливают в тубусе или на окуляре микроскопа). Источниками света служат ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления или лампы накаливания точечного типа. Яркое цветное свечение объектов на темном фоне обеспечивает высокий контраст. Оптико-механическая промышленность выпускает специальные люминесцентные микроскопы и отдельные осветители.

       Лишь немногие биологически значимые вещества имеют выраженную собственную люминесценцию в видимой области спектра. К ним относятся некоторые пигменты (хлорофилл, порфирины, липохромы), витамины А и В2, алкалоиды (берберин, хинин и др.), антибиотики (тетрациклины и др.), химиотерапевтические и токсические вещества. Проникновение этих веществ в органы и клетки, их распределение и превращения могут быть прослежены при помощи прижизненной люминесцентной микроскопии. Чаще в люминесцентной микроскопии используют люминесцентную «окраску» специальными веществами (флюорохромами), избирательно придающими тонким структурам клетки и тканей способность люминесцировать (люминесцентная цитохимия). Так, например, флюорохром акридиновый оранжевый применяют для контрастирования ядерных структур, выявления нуклеиновых кислот, мукополисахаридов, для обнаружения микробов и крупных вирусов, для цитодиагностики, в том числе распознавания в мазках раковых клеток; аурамин 00 служит для выявления кислотоустойчивых бактерий (туберкулеза, проказы), риккетсий и некоторых вирусов; примулин — для флюорохромирования элементарных телец вирусов и различения живых и мертвых клеток; фосфин ЗК, нильский голубой и бензпирен — для локализации липидов в клетках. 
Особое значение в люминесцентной микроскопии придается люминесцентно-иммунологическим методам, основанным на применении люминесцентно меченных специфических сывороток (антител). Метчиком чаще служит флюорохром изотиоцианат флюоресцеина. Получаемый комплекс «антитело-флюорохром» позволяет быстро обнаруживать, идентифицировать и локализовать даже ничтожные количества соответствующих антигенов, в том числе вирусов, риккетсий, бактерий на фоне посторонней микрофлоры, а также выявлять специфические белки, ферменты, полисахариды в клетках и тканях. Наряду с визуальными наблюдениями и фотографированием в люминесцентной микроскопии все шире применяется объективная регистрация интенсивности, спектров и выхода люминесценции.

       В СССР развивается новый вид люминесцентная микроскопия— так называемая ультрафиолетовая Л.м., при помощи которой исследуется собственная ультрафиолетовая невидимая в обычных условиях люминесценция объектов, тонко отражающая особенности их физиологического состояния. 

       Люминесцентная микроскопия клеток и тканей. При люминесцентной микроскопии можно изучать первичную (ткани и органы человека и животных имеют нерезкую белесую, голубую или синюю люминесценцию) и вторичную люминесценцию клеток и тканей. Изучение вторичной люминесценции живых и фиксированных клеток и тканей (после их «окраски» флюорохромами) получило широкое распространение. При изучении живых клеток флюоресцирующие вещества применяют в очень малых количествах, не вызывающих токсического действия. В цитологических исследованиях Л. м. применяют при диагностике злокачественных новообразований в соскобах, пунктатах, мокроте, промывных водах. Этот метод позволяет быстро получить ярко окрашенный препарат, в котором атипичные клетки выделяются ярким свечением, оттенками цвета и структурой применяется и в гистохимии. Использование акридинового оранжевого позволяет выявить нуклеиновые кислоты, при этом ДНК дает зеленую, а РНК — красную флюоресценцию. Тот же флюорохром в нефиксированных срезах помогает выявить мукополисахариды, а при модификации этого метода — муцины. Фосфин 3R, родамин В, бензпирен и др. выявляют в срезах липиды.

ЛЮМИНОФОРЫ

(от лат. lumen, род. падеж luminis - свет  и греч. phoros - несущий), синтетич. в-ва, способные преобразовывать разл. виды энергии в световую - люминесцировать. По типу возбуждения подразделяются  на фото-, катодо-, электро-, рентгено-, радио-, хемилюминофоры и др. 

     Неорганические люминоформы(фосфоры). Их свечение могут быть обусловлено как свойствами вещества основы, так и наличием примесей - активаторов, которые образуют в основном веществе центры свечения, соактиватора и сенсибилизатора. Концентрация активатора обычно составляет 10-1-10-3%. Существуют самоактивирующие люминоформы, не содержащие активаторов, напр. CaWO4. Л. обозначают формулой основы с указанием активатора и сенсибилизатора, часто соактиватора, напр. ZnS : Ag, Ni; вещество после знака ":" - активатор, соактиватор или сенсибилизатор. Большинство неорганические люминофоры имеет кристаллическую структуру и относятся к кристаллофосфорам. Требования к люминофорам - яркость и цвет свечения, длительность послесвечения, дисперсность, термостойкость и др. - определяются параметрами устройств, в которых их применяют. Люминофоры обычно используют в виде относительно тонких поликристаллических слоев (1-100 мкм), наносимых на внутреннюю поверхность светящихся - экранов электровакуумных приборов. Состав некоторых фото- и катодолюминофоров и области их применения представлены в таблице. Фотолюминофоры возбуждаются оптическим излучением в диапазоне от вакуумной УФ до ближней ИК области, наиболее широкое применение фотолюминофоры находят в люминесцентных лампах низкого давления. В лампах для общего освещения используют галофосфат Са -3[Са 3 (РО 4)2].Са(Сl, F)2 : Sb, Mn, в лампах высокого давления с исправленной цветопередачей - смеси на основе фосфатов и силикатов, излучающие в синей, зеленой и красной областях спектра. Свечение возбуждается резонансной линией Hg с l =253,7 нм. Световая отдача (отношение светового потока лампы к мощности) ламп с галофосфатным дюминофором составляет 85 Лм/Вт, ламп со смесями - от 50 до 60 Лм/Вт. Созданы лампы "нового поколения" с люминофором на основе РЗЭ (алюминаты, фосфаты и др.), сочетающие высокую светоотдачу (~ 95 Лм/Вт) с высоким качеством цветопередачи. Фотолюминофоры применяют для исправления цветности ламп высокого давления, ламп, излучающих в УФ области, и т. д. (см. табл.). Катодолюминофоры возбуждаются пучком электронов; используются в экранах кинескопов, в электронных микроскопах, электроннолучевых и радиолокационных установках. В кинескопах цветного изображения применяют люминофоры с синим (l макс 455 нм), зеленым (l макс 525 нм) и красным (l макс 612 и 620 нм) цветом свечения. Их наносят на экран кинескопа в виде точек, расположенных треугольником, или чередующихся полос. Суммарный цвет изображения получается при сложении трех цветов свечения нанесенных люминофор и зависит от соотношения их яркостей. Для получения хорошей цветопередачи цвет свечения исходных люминофоров должен быть по возможности более насыщенным, для чего поверхность "синего" Л. пигментируют СоАl2 О 4, а "красного" - Fe2O3.  
  
  
* При напряжении 6 кВ. ** При напряжении 14 кВ. *** При напряжении 12 кВ.