Изучение влияния тяжелых металлов на рост и развитие пшеницы

      Однако, поскольку растения стали повсеместно подвергаться действия избытка многих элементов сравнительно недавно, у них еще не выработались  совершенные механизмы адаптации к ним. Уже, установлено, что у различных видов вырабатываются специфические механизмы устойчивости, которые определяются не только видовыми особенностями растений, но и химическими свойствами соединений металлов. Например, одни виды избавляются от  избытка этих элементов путем выделения их во внешнюю среду, в вакуоли или в свободные пространства клеточных стенок, другие путем связывания их в метаболические не активные органические комплексы, нерастворимые в воде.   [25] Ряд видов выделяют такие комплексы в атмосферу. К примеру, хвойные выводят комплексы железа, меди, цинка и других металлов с терпенами; большинство растений избавляются от ртути, свинца, кадмия путем выделения их в виде метилированных  производных и т.д. дальнейшее изучение механизмов адаптации растений к токсическим выбросам, вероятно, позволит найти способы повышения устойчивости к ним культурных растений.   [36]   

 

1.6. Механизмы поступления тяжелых  металлов в растения.

       Поглощение ионов из почвы или питательного раствора корневыми системами осуществляется разными путями, от которых зависит вероятность поступления иона непосредственно в цитоплазму клеток и скорость его перемещения по тканям и органам растений.  [5,29]

      Иммобилизация может происходить за счет неметобалического    необратимого связывания их ограниченным числом участков, расположенных на поверхности клеточной стенки и вдоль симпласта корней. С одной стороны ионы, необратимое связывание предотвращает передвижение части токсических ионов по клеткам и тканям растений, с другой – этот процесс способствует установлению концетрированного градиента и позволяет в дальнейшем аккумулировать элемент посредством диффузии.   [29]  

     В случае обратимого связывания иона компонентами клеточной стенки путем обменной  физико- химической сорбции, он может пассивно диффундировать в симпласт при наличии концентрационного градиента, что обеспечивает транспорт иона по растению. Участки, задействованные в обменной абсорбции, не обладают селективностью. С их участием поступают Cd, Zn, Cu, Hg и другие металлы. Накопление ионов металлов в свободном пространстве клеточной стенки определяется величиной ионообменного коэффициента, которая в значительной степени зависит от количества гистидильных групп белков, а также карбоксильных групп, размещенных на поверхности пектинов .   [12]  Обменно связанная фракция ионов металла легко вымывается из корневых систем растений при замене питательного раствора на не содержащий данный элемент.   [29]  

      Проникая через клеточную стенку, одна часть ионов связывается с реактивными компонентами апопласта, другая поступает в цитозоль. Существуют данные, свидетельствующие, что двухфазный  характер поступления металлов, например Cd, в корневые системы отражает два выше указанные процесса  .   [25]  Причем линейный участок зависимости поглощения Cd  иона металла от времени соответствует связыванию Cd с компонентами апопласта, а плато (фаза насыщения) является результатом транспорта Cd через плазматическую мембрану в клетки корней. Важно, что в цитируемой работе линейно зависящие от времени поглощения наблюдали при крайне низких концентрациях этого элемента в растворе – от 2,2 до 56,2 мкг/л, тогда как в случае высокого (более 1 г/л) его содержание в субстрате быстро достигался выход на плато. Отсюда следует, сто микроколичества Cd и, видимо, других ТМ могут эффективно задерживаться клеточной стенкой или реактивными центрами апопласта. Эти же механизмы предотвращает поступление избыточных количеств ТМ в клетки, и ограничивают поступление ионов металлов по тканям растений. Данный факт имеет большое значение при выборе концентраций токсиканта для исследования его генетических эффектов действия на растения.

      В случае повышенных концентраций ТМ в питательной среде указанные механизмы не могут полностью исключить поступление ионов через плазматическую мембрану в цитозоль, транспорт молекул через мембраны осуществляется разными путями в зависимости от механических свойств элементов и их биологической значимостью. Небольшие нейтральные молекулы могут проникать через мембраны за счет обычной диффузии в мембране и градиентом концентраций снаружи и внутри клетки. [6]

Транспортные  системы биологических мембран принято разделять на системы ионных каналов и переносчиков. Ионные каналы селективны, они катализируют диссипативный транспорт. Переносчики не обладают высокой избирательностью. [12] При этом вещество соединяется с пеносчиком в участке  связывания и транспортируется через мембрану, где освобождается в результате  конформационных перестроек  белка- переносчика. Транспорт ионов часто осуществляется не одним, а системой последовательных переносчиков. [25] 

Поступившие в цитоплазму ионы могут связываться там с биомолекулами. В этом случае хиллатный комплекс либо выводится из клетки, либо аккумулируется в ней (чаще всего в вакуолях). Механизмы внутриклеточной детоксикации будут подробно расмотренны в следующем разделе. Здесь отметим только, что аккумуляция токсичных ионов в вакуолях в виде малоподвижных соединений в большей мере характерна для растений, толерантных к ТМ.   [7]

Оставшаяся  в цитоплазме в виде свободных  ионов или растворенных комплексов фракция симпластическим или  трансклеточным  путем перемещается из корня в побег и далее- в листья растений по зараженным участкам ксилемы, либо увлекается с транспирационным потоком воды. [5,21]

Приведенные выше данные показывают, что не все  поглощенные растениями ионы активно влияют на его метаболизм. Часть токсичных ионов оказываются прочно связанной с реакционно-способными участками на поверхности клеточной стенки и в апопласте, проникая через плазмолемму – с внутриклеточными биомолекулами. Какая доля ионов  данного металла окажется в свободном виде, а какая - связанной с органическими молекулами, зависит от нуклеофильности лиганда, pH среды и химических свойств элемента. Стабильность комплексов металлов уменьшается в случае отклонения pH  среды от нейтральной реакции: при низких pH в силу конкуренции протона с ионом металла за центры связывания в молекулах, а при высоких - по причине конкуренции гидроксильной группы с лигандом.  [6]   Важно учитывать, что многозарядные ионы образуют более прочные комплексы, чем однозарядные, обладающие меньшей плотностью заряда.

На поступление  и передвижение ионов металлов по растению существенно влияет ионное окружение.   [2,4,21]  При этом наибольший антогонизм проявляют элементы аналоги и гомологи и катионы одинаковой валентности, способные образовывать сходные комплексы. [1,2]  Так, транспорт Cd в корневые системы снижается при добавлении в раствор Ca, Zn  или Mn. Известно, что Zn конкурентно ингибирует поступление в клетку, осуществляемое посредством системы переносчиков. Случаются случаи проявления синергизма при  поступлении ионов. Так, на примере взаимоотношения пар  Cd - Rb и Ca- Na показано, что увеличение поглощение двухвалентных катионов происходит при наличии в растворе одновалентного катиона в высокой концентрации.

Соотношение концентраций элемента, находящегося в растении прочно связанном и подвижном состоянии, обуславливает, очевидно, не только степень влияния данного иона на метаболизм, но также определяет клеточные структуры и связанные с их функцией процессы, подверженные максимальному воздействию со стороны токсиканта. Прочно связанные с биомолекулами ионы металлов могут депонироваться в определенных органах, что ограничивает их транспорт и влияние на жизнедеятельность растений. Этот процесс, относимый к механизмам детоксикации, существенно снижает биологическую эффективность ТМ. [5,25]

 

 

 

 

 

 

 

 

II  Экспериментальная часть

 

2.1. Методы и материалы

  Исследования проводились на базе лаборатории биологии и биотехнологии Евразийского Национального Университета. Входе исследований были использованы семена пшеницы. Одинакового размера семена пшеницы обрабатывали 25-30 минут этанолом. Для стериализации от бактерий. Затем их промывали дистиллированной водой. Процесс прайминг семян проводилось следующим образом: сухие покоящиеся семена  пшеницы были помещены на дно сосуда в дистиллированную воду с раствором молибдата, и с раствором вольфрама. Семена замачивались в течении 30 часов. Предварительные эксперименты показали, что в течении этого времени семена полностью насыщаются водой или этими растворами. Затем семена сушили на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. После 20-30 часов высушивания семена стали полностью сухими, т.е. они достигают своей исходной массы. Прорастание семян проводилось на влажной фильтровальной бумаге, в чашках Петри с добавлением различных концентраций тяжелых металлов: цинк- 1 мкМ, 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ, медь- 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1 млМ, 10 млМ, свинец- 100 мкМ, 1 млМ, 10 млМ, 50 млМ, 100 млМ, кадмий- 1мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ. Каждый вариант сопровождается двумя повторностями. Затем после 12 дней проращивания определяли свежий вес листьев и корней. Проростки разделяли на листья и корни, промывали их дистиллированной водой, затем удаляя воду фильтровальной бумагой. Общий вес листьев и корней 20  проростков взвешивали на весах «Метлертоледо».

         Экстракты листьев и корней получили следующим образом: 1 грамм растительного материала поместили в ступку и добавляли 0,5 грамм чистого песка, затем добавляли 0,1 мМ натрифосфатный буфер, pН которого равен 7,5, содержащий 10 мкМ лейпептина и 10 мкМ ФАД. Ступку и буфер предварительно охлаждали в холодильнике. Затем пестиком смесь растительного материала и песка гомогенизировали до однородной массы. Полученную массу переносили в центрифужный  стакан и центрифугировали. Центрифугирование проводили в течении 15 минут на центрифуге «Fn» при скорости 8 тыс оборотов. Полученные прозрачные растительные вытяжки (экстракт) содержали при низкой температуре во льду. Выпавший осадок выбрасывали.

Обнаружение тяжелых металлов в проростках пшеницы проводили гистохимическим методом.

Тяжелые металлы  способны давать красное окрашивание при реакции с дитизоном. Дитизон обладает высокой чувствительностью к тяжелым металлам и образует в присутствии исследуемых металлов нерастворимые соли – дитизонаты, окрашенные в красный цвет. Дитизон и дитизонаты практически нерастворимы в нейтральных и кислых водных растворах. Помимо кадмия и свинца Дитизон может образовывать окрашенные комплексы с цинком, кобальтом, медью, хромом, железом, никелем и некоторыми другими металлами.

Для обнаружения  тяжелых металлов проростки пшеницы  и растворы металлов в концентрации 10^-3М Pb (NO₃)_2, 10^-4М Cd(NO₃)₂, 10^-3М Cu(NO₃)₂, 10^-3М Zn(NO₃)_2. проростки выращивали в чашках Петри.

Для определения  локализации  Pb, Cd, Cu и Zn готовили серии поперечных срезов корня на разных расстояниях от апекса, а также срезы колеоптиля.

Серии срезов помещали  на предметное стекло, на него переносили  3 – 4 капли дитизона, накрывали покровным стеклом  и через несколько минут рассматривали под микроскопом при разных увеличениях.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Результаты  и обсуждения

 

         Для изучения влияния тяжелых  металлов на всхожесть пшеницы были использованы следующие металлы: цинк, медь, свинец и кадмий. Рост пшеницы ингибировали тяжелыми металлами в разной степени в зависимости от их концентрации. (Таблица 1).

          20 семян проращивали в различных концентрациях тяжелых металлов - цинка, меди, свинца и кадмия.

 

Таблица1-Влияние  тяжелых металлов различных концентраций на рост пшеницы.

Тяжелые металлы	Концентрация  ТМ	Общий вес  растения (гр.)	%
Вода	0	34,7 ± 5,6	100
Цинк	100 мкМ	34,2 ± 6,7	98,5
	1 мМ	27,3 ± 5,2	78,6
	10 мМ	20,3 ± 4,5	58,5
	50 мМ	8,6 ± 3,1	24,8
	100 мМ	0,8 ± 0,2	2
Медь	1мкМ	30,2 ± 4,5	87
	10 мкМ	23,5 ± 5,3	67,7
	100 мкМ	14,5 ± 3,6	41,7
	1 мМ	5,4 ± 1,2	15,5
	10 мМ	0,5 ± 0,2	1,4
Свинец	100 мкМ	31,3 ± 7,4	90,2
	1 мМ	20,3 ± 6,2	58,5
	10 мМ	14,2 ± 2,4	40,9
	50 мМ	2,1 ± 0,5	6
	100 мМ	0,4 ± 0,1	1
Кадмий	1 мкМ	28,2 ± 6,3	81,2
	10 мкМ	15,3 ± 4,4	44
	20 мкМ	7,4 ± 1,3	21,3
	30 мкМ	2,8 ± 0,6	8
	50 мкМ	0,7 ± 0,2	2

 

Рисунок 1  Влияние ТМ различной концентрации на рост пшеницы

 

 

Как видно  из таблицы, ингибиторами оказались  медь и кадмий, а другие тяжелые  металлы Zn и Pb, слабо влияли на рост растений. Для ингибирования роста пшеницы требовались очень большие концентрации цинка и свинца. Например: для одинакового ингибирования роста пшеницы требовалось такая концентрация цинка и свинца, которая более чем в 1000 раз превосходила концентрацию кадмия.

Необходимо отметить, что особенности транспорта и распределения металлов в корнях растений определяют их способность накапливать металлы в подземных или надземных органах.

По литературным данным известно, что различные тяжелые металлы поглощаются ризодермой и передвигаются по ней не одинаково. Так, например, Pb обнаруживался, главным образом, в апопласте, следовательно, они транспортируются по апопласту. Pb связывается с материалом клеточных оболочек более сильно, чем Cd, а, следовательно, и скорость его движения по апопласту будет наименьшей [84]. Клеточные оболочки, связывая большое количество металлов, могут ограничивать их поступление в цитоплазму.

Далее мы изучали влияние и распределение тяжелых металлов в проростках пшеницы. Результаты исследований представлены в таблице 2.

 

Таблица2-Влияние тяжелых металлов на рост корневой системы пшеницы.

Вариант опыта	Длина главного корня		Длина  колеоптиля		Длина зоны боковых  корней
	см	%	см	%	см	%
Контроль	17,85± 0,24	100	2,5 ±0,1	100	15 ±0,16	100
Zn	16,9 ±0,6	94,6	2,3± 0,24	92	14 ±0,2	93
Cu	14,8 ±0,24	83	1,5± 0,2	60	12,1± 0,12	80
Pb	16,0 ±0,23	90	2,1± 0,5	84	13± 0,34	86
Cd	12,1± 0,13	67,7	1,4± 0,35	50	10± 0,15	66