Психологическое и организацонное сопровождение ВИЧ

Часть 1. Клиника, диагностика и лечение ВИЧ-инфекции

Часть 1 
Клиника, диагностика и лечение ВИЧ-инфекции 

1.1. Этиология, эпидемиология, патогенез ВИЧ-инфекции 
 
ВИЧ-инфекция - болезнь, развивающаяся в результате многолетнего персистирования в лимфоцитах, макрофагах и клетках нервной ткани вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и характеризующаяся медленно прогрессирующим дефектом иммунной системы, который приводит к гибели больного от вторичных поражений, описанных как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), или от подострого энцефалита. 
 
Вирус иммунодефицита человека относится к семейству ретровирусов. Это РНК-вирус, содержащий фермент - обратную транскриптазу, наличие которого позволяет синтезировать вирусную ДНК и обеспечивает тем самым интеграцию генетического материала вируса и клетки хозяина. В настоящее время известны 2 типа вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2, последний встречается в основном в Западной Африке. В состав ВИЧ-1 входят следующие основные белки и гликопротеиды (антигены): структурные белки оболочки (env - gp160, gp120, gp41), ядра (gag- p17, p24, p55), а также ферментов вируса (pol - p31, p51, p66). 
 
ВИЧ-2 содержит: env gp140, gp105, gp36; gag-p16, p25, p56; pol - p68. Принято считать, что ВИЧ-2 имеет сходные свойства, распространяется теми же путями, что и ВИЧ-1 и вызывает подобное ВИЧ-1 заболевание. Вероятно, инфекция, вызываемая ВИЧ-2, имеет некоторые отличия. Наиболее распространено мнение, что ВИЧ-2 имеет меньшую способность к распространению и медленнее разрушает иммунную систему, но научных разработок, освещающих этот вопрос, пока недостаточно. 
 
Источником ВИЧ-инфекции является человек. Почти во всех биологических жидкостях инфицированного человеческого организма (кровь, сперма, спинномозговая жидкость, грудное молоко, влагалищный и цервикальный секрет) в различной концентрации обнаруживаются вирусные частицы. 
 
ВИЧ может передаваться при половых контактах, при переливании инфицированной крови и ее препаратов, использовании контаминированного ВИЧ медицинского инструментария, от инфицированной матери ребенку и от инфицированного ребенка матери во время кормления грудью, а также от инфицированной матери ребенку во время беременности и родов. 
 
ВИЧ преимущественно избирательно поражает клетки, имеющие CD4-рецепторы, на которые адсорбируется ВИЧ: Т-лимфоциты хелперы, макрофаги, В-лимфоциты, клетки нейроглии, клетки слизистой кишечника, дендритные и некоторые другие клетки. 

На основании четкой связи прогрессирования заболевания со снижением у больного количества СD4-лимфоцитов считают, что уменьшение количества этих клеток является главной особенностью патогенеза заболевания. Однако механизм этого процесса не имеет пока убедительных объяснений. Нарушается и функция лимфоцитов хелперов/индукторов, приводящая к спонтанной активации В-клеток и развитию поликлональной гипергаммаглобулинемии за счет продукции неспецифических иммуноглобулинов, повышается концентрация циркулирующих иммунных комплексов. В результате снижается сопротивляемость к вторичным инфекциям и неоплазмам. Кроме того, за счет прямого цитопатического действия вируса или в результате опосредованного действия (аутоиммунные механизмы) возможно поражение клеток нервной системы, различных клеток системы крови, сердечно-сосудистой, костно-мышечной, эндокринной и других систем. Все это обусловливает разнообразие клинической симптоматики и полиорганность поражений. 

1.2. Лабораторные  критерии для постановки диагноза  ВИЧ-инфекции 
 
Основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к вирусу с помощью иммуноферментного анализа. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% через 6 месяцев от момента заражения и у 0,5-1 % в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител - 2 недели от момента заражения. В терминальной фазе СПИД количество антител может значительно снижаться, вплоть до полного их исчезновения. Серологическая диагностика инфекции ВИЧ на первом этапе строится на выявлении суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На втором этапе методом иммунного блотинга (Western blot) проводится определение антител к отдельным белкам вируса. 

1.2.1. Забор материалов, транспортировка и хранение сывороток  крови. 
 
Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь. Полученный материал не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при +4-8° С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. Лучше всего сразу после взятия крови отобрать из нее сыворотку. Сыворотка отделяется центрифугированием или обводкой крови по стенке пробирки пастеровской пипеткой, либо стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может храниться до 7 дней при температуре +4-8° С. 
 
При работе следует соблюдать правила техники безопасности, приведенные в "Инструкции по противоэпидемическому режиму в лабораториях диагностики СПИДа" N 42-28/38-90 от 5 июля 1990 года. 

1.2.2. Оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного  анализа. 
 
Для проведения лабораторных исследований с помощью ферментных методов необходимо иметь следующее оборудование: 

1. спектрофотометр; 

2. отмыватель планшетов; 

3. термостат; 

4. автоматические  пипетки; 

5. наконечники  к автоматическим пипеткам; 

6. центрифуги; 

7. холодильники; 

8. тест-системы. 
 
В настоящее время в России рекомендовано к применению достаточное количество тест-систем для выявления антител к ВИЧ. Все они основаны на общем принципе иммуноферментного анализа. 
 
Нагрузка на бригаду ИФА-диагностики должна составлять до 400 исследований в смену, при условии оснащения современным автоматическим оборудованием и до 180-200 исследований, оснащенных отечественным рутинным оборудованием. 

1.2.3. Иммуноферментный  анализ. 
 
Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фасфотаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем - полистироловый планшет с лунками или полистироловые шарики, на поверхности которых сорбирован антиген: вирусный лизат, рекомбинантные белки или синтетические антигенные детерминанты. Из всех модификаций твердофазного ИФА для диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, наиболее широко применяются непрямой и конкурентный варианты. 

1.2.3.1. Принципы  постановки непрямого метода  ИФА. Предварительно приготовленный  согласно инструкции, прилагаемой  к набору, исследуемый материал (сыворотка, плазма) вносится в лунку планшета. Если этого требует методика, планшет предварительно отмывается. Несколько лунок планшета заполняются контрольными сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к ВИЧ. При работе с контрольными сыворотками необходимо строго соблюдать инструкции по применению диагностической тест-системы, т.к. интерпретация результатов зависит от значении оптической плотности контрольных сывороток. Планшет с внесенными контрольными сыворотками и исследуемым материалом инкубируется при условиях, указанных в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они образуют комплекс с антигеном, сорбированным на поверхности лунок планшета. Несвязавшиеся с антигеном антитела удаляются при отмывке планшета. 
 
Затем во все лунки планшета вносят конъюгат-антитела против иммуноглобулинов человека, меченые ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). При последующей инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-конъюгат. Несвязавшийся конъюгат удаляется во время отмывки планшета. Наиболее широко применяемым индикаторным ферментом для ИФА является пероксидаза хрена. Субстратом для нее является перекись водорода. 

Эта реакция протекает без видимых проявлений. Изменение окраски раствора происходит при окислении красителей (ортофенилендиамина или др.), который входит в состав субстратного раствора. 
 
Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом, происходит окрашивание только тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген-антитело-конъюгат. Иногда окрашивание может быть результатом неспецифического связывания иммуноглобулинов с антигенами ВИЧ. Учет реакции проводят на спектрофотометре (ридере) при длине волны, указанной в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Длина волны зависит от красителя, используемого в тест-системе. 

1.2.3.2. Принцип  постановки конкурентного метода  ИФА. 
 
При конкурентном методе ИФА в лунки планшета с нанесенным антигеном одновременно вносятся исследуемые сыворотки и конъюгат. Конъюгат в данном случае - это антитела против ВИЧ, меченые ферментом. При последующей инкубации антитела, содержащиеся в сыворотке, и конъюгат вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизированными на твердом носителе антигеном. Если сыворотка содержит антитела, они взаимодействуют с антигеном, блокируя образование комплекса антиген-конъюгат. При отсутствии антител в сыворотке происходит образование комплекса антиген-конъюгат. Оставшиеся несвязанные компоненты после инкубации отмываются и в систему добавляется соответствующий субстрат. При наличии антител в сыворотке цветная реакция не развивается. 
 

Таблица 1. Возможные ошибки при проведении ИФА

Таблица 1 

 
При постановке ИФА в случае получения положительного результата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой). При получении хотя бы еще одного положительного результата сыворотка направляется в референс-лабораторию. 

1.2.3.3. Иммунный  блотинг. 
 
В настоящее время для подтверждения специфичности первичного положительного результата чаще всего используется метод иммунного блотинга-Wester N blot. Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. В организме человека образуются антитела к ряду компонентов вируса, данные об этих антигенах приводятся в таблице. 
 

Таблица 2

Таблица 2 

 
Примечание: Молекулярный вес белков выражается в килодальтонах - кд, гп - гликопротеины, п - протеины. 
 
Подготовка нитроцеллюлозных мембран для тест-системы производится следующим образом. На первом этапе производят разделение белков вируса иммунодефицита человека по молекулярному весу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Белки мигрируют в слоях геля при наложении электрического потенциала: белки с низким молекулярным весом проходят через поры в полиакриламидном геле легче, чем белки с высоким молекулярным весом и быстрее достигают конца геля. В результате этого происходит разделение белков на отдельные полосы по молекулярному весу. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембрана обрабатывается блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов сывороток крови, затем отмывается, высушивается и разрезается на отдельные полоски, которые вкладываются в набор. Перенесенные таким образом белки выявляются на нитроцеллюлозной реплике (блоке) с помощью непрямого анализа, а именно: сыворотка или плазма инкубируются с блотом; если исследуемый материал содержит антитела к белкам ВИЧ, они связываются с антигеном, перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану, после отмывки полоски блота инкубируются с конъюгатом; при образовании комплекса антиген-антитело, конъюгат присоединяется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с субстратом происходит окрашивание тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген-антитело-конъюгат. Полученный результат сравнивается с результатами тестирования положительной и отрицательной контрольных сывороток. 
 
Результаты, полученные в иммунном блоттинге интерпретируются как положительные, сомнительные и отрицательные.