Технология получения интерферона

МИНИСТЕРСТВО  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                           РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

кАЗАХСКИЙ АГРОТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ 

ИМЕНИ С.СЕЙФУЛЛИНА

кафедра ветеринарной микробиологии и биотехнологии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

 

по дисциплине « Биотехнология  микроорганизмов»

 

На тему: «Технология получения интерферона»

 

 

Выполнила: Шрамко Алла Юрьевна___________________________

 

 

 Проверила:  _______________________________________________

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Астана 2010

Содержание

 

		стр
	Определения	3
	Обозначения и сокращение	4
	ВВЕДЕНИЕ	5
1.	История открытия интерферона	7
2.	Особенности получения  интерферонов	8
2.1	Технология получения  лейкоцитарного интерферона	8
2.2	Технология получения  интерферона генно-инженерным методом	16
3.	Механизмы действия интерферонов	22
4.	Терапевтическое применение ИНФ человека	22
	ЗАКЛЮЧЕНИЕ	24
	СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ	25
	ПРИЛОЖЕНИЕ	26

 

 

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

 

В настоящей курсовой работе применяются следующие определения:

Антигены – вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации, способные вызывать в организме формирование иммунных белков – антител.

Антитела – белки глобулиновой природы, образующиеся в организме в ответ на введение антигена.

Белки – природные высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в длинные цепи.

Иммуногенность – свойство антигена вызывать иммунный ответ в организме.

Интерферон – защитный белок, вырабатываемый клетками млекопитающих и птиц в ответ на заражение их вирусами; неспецефический фактор противовирусного иммунитета.

Лимфокины — растворимые низкомолекулярные полипептиды (цитокины). Секретируются стимулированными антигеном лимфоцитами. Способны изменять функциональную активность клеток и тканей, имеющих комплементарные рецепторы.

Лиофилизация — способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый препарат замораживается, а потом помещается в вакуумную камеру, где и происходит возгонка растворителя.

Транскрипция - ферментативный процесс передачи генетической информации одной цепи ДНК для синтеза комплиментарной нуклеотидной последовательности в структуре мРНК

Трансляция - процесс использования генетической информации мРНК для синтеза белка соответствующей аминокислотной последовательности.

Фибробласты — клетки соединительных тканей организма, синтезирующие внеклеточный матрикс. Фибробласты секретируют предшественников белков коллагена и эластина, а также мукополисахариды.

Фракционирование - (ректификация), разделение смеси веществ посредством кристаллизации (фракционная кристаллизация) или дистилляции (фракционная дистилляция).

Центрифугирование — разделение неоднородных систем (напр., жидкость — твердые частицы) на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Центрифугирование осуществляется в аппаратах, называемых центрифугами. Центрифугирование применяется для отделения осадка от раствора, для отделения загрязненных жидкостей. Для исследования высокомолекулярных веществ, биологических систем применяют ультрацентрифуги.

 

 

 

ОБОЗНАЧЕНИЯ И  СОКРАЩЕНИЯ

 

В настоящей курсовой работе применены следующие обозначения и сокращения:

 

ИФН	–	Интерферон
л	–	Литр
г	–	Грамм
кг	–	Килограмм
кД	–	Килодальтон
кл/мл	–	количество клеток в  миллилитре
М	–	молярность раствора
мг	–	Миллиграмм
мкг	–	Микрограмм
мл	–	Миллилитр
мкл	–	Микролитр
об/мин	–	количество оборотов в минуту
ДНК	–	дезоксинуклеиновая кислота
РНК	–	рибонуклеиновая кислота
мРНК	–	матричная РНК
кДНК	–	комплементарная ДНК
рН	–	водородный  показатель – величина, характеризующая  концентрацию ионов водорода и кислотность среды
тыс.	–	Тысяч
°С	–	Градус
млрд	–	миллиард
млн	–	Миллион
E.coli	–	Escherichia coli

 

ВВЕДЕНИЕ

        

         Биотехнология все активнее входит в жизнь современной цивилизации. К настоящему времени мировой рынок ее продукции оценивается почти в 163 млрд долл. Основными секторами этого стремительно развивающегося рынка являются продукты для пищевой промышленности и сельского хозяйства, фармацевтическая продукция, ферменты и препараты для производства моющих средств, посадочный материал модифицированных растений и частично фармацевтические косметические средства, полученные из натурального растительного или животного сырья.

Особый интерес представляют два наиболее перспективных направления биотехнологии, объединенных общим названием «современная биотехнология» - а именно генетическая и клеточная инженерия, позволяющие создание промышленной технологии производства широкого спектра генно-инженерных препаратов: инсулина, гормона роста человека, интерферонов (противоинфекционных, противовирусных и противораковых средств), моноклональных антител и др.

Наиболее универсальными и безопасными препаратами, применяемыми в борьбе с различными вирусными  и инфекционными препаратами является интерфероны (ИФН), представляющие собой группу аутогенных гликопротеинов, биомеханизм действия которых связан с одновременным противовирусным эффектом - активацией клеточных генов, в результате чего синтезируются белки, ингибирующие синтез вирусной ДНК (РНК) и обладающие иммуномодулирующим эффектом, т.е. способностью усиливать экспрессию антигенов на клеточных мембранах и увеличивать активность цитотоксических Т-клеток и естественных   киллеров [1].

Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон, продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители.

ИФН подразделяются на два  типа. К первому типу, действующему как ингибиторы репликации вируса и оказывающему преимущественно противовирусный эффект, относятся 22 различных подтипа ИФН-α и один подтип ИФН-β. Ко второму типу, проявляющему иммуномодуляторную активность, относятся ИФН-γ. Существует три иммунологически различных класса ИФН: ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ.

К ИФН естественного  происхождения относятся лимфобластоидный и лейкоцитарный ИФН (ИФН-α), синтезируемые соответственно стимулированными моноцитами и В-лимфоцитами человека, которые затем экстрагируются и очищаются; фибробластный ИФН (ИФН-β), получаемый из культуры фибробластов человека, и Т-лимфоцитарный ИФН (ИФН-γ).

К искусственно синтезируемым ИФН относится рекомбинантный ИФН-α, который представляет собой высокоочищенный единственный подтип ИФН-α, получаемый по рекомбинантной молекулярной      технологии [2].

Учитывая актуальность данного направления нами была поставлена цель изучить особенности технологии получения интерферона.

Для достижения поставленой  цели поставлены следующие задачи:

1. Ознакомиться с историей открытия интерферона;

2. Изучить основные способы получения интерферона, их преимущества и недостатки;

3. Механизмы действия  и терапевтическое действие интерферонов.

 

 

 

1 История открытия

 

В 1957 г. вирусологи - сотрудники Лондонского национального института  англичанин Айзекс и швейцарец Линдеман случайно во время опытов открыли интерферон. Исследователи столкнулись с непонятным явлением: мыши, которых заражали определенными вирусами, не заболевали.

Поиски причин этого  явления показали, что мыши, не поддавшиеся  заражению вирусами, в момент заражения уже болели другой вирусной инфекцией. Оказалось, что в организме мышей один из вирусов препятствует размножению другого. Это явление антагонизма вирусов назвали английским словом "интерференция", что означает "помеха", "препятствие". Оно отмечается при введении в организм двух вирусов одновременно или с интервалом не более 24 часов. Исследователи предположили, что в этой борьбе вирусов участвует белок. Соответствующий низкомолекулярный белок был обнаружен и назван интерфероном.

В течение следующих 20 лет велись интенсивные исследования. Было установлено, что интерфероны - группы белков, относящиеся к 3 классам - alpha, betta и gamma. Лейкоциты крови выделяют интерферон типа alpha , фибробласты типа betta и T- лейкоциты типа gamma.

Интерфероны выделили, очистили и проявили их эффект как антивирусных фармацевтических средств. Не считая того, эти белки оказались действенными при лечении растерянного склероза и неких видов рака. Единственным препятствием к использованию интерферонов была их малая доступность. Они синтезировались в совсем малых количествах: источником их получения была либо донорская кровь, либо культура клеток человека. К огорчению, эти источники не позволяли получать интерфероны в количестве, подходящих медицине.

В 1980 - 1985 гг. в нескольких лабораториях мира, в том числе и в бывшем СССР, были выделены гены человека, определяющие синтез интерферонов, и введены в бактерии. Такие бактерии стали способны синтезировать человеческий интерферон. Очень важно, что они быстро растут, употребляют дешёвую питательную среду и синтезируют огромное количество белка. Из 1 л бактериальной культуры можно выделить столько человеческого интерферона alpha, сколько из 10 тыс. л. донорской крови. Приобретенный белок полностью схож интерферону, синтезируемому в организме человека. Естественно, пришлось решать сложную задачу очистки интерферона, приобретенного методом генной инженерии, до гомогенного состояния.

Ещё 4 - 6 лет заняли доклинические  и клинические тесты. В конце  концов в 1989 -1990 гг. возникло новое лекарство - человеческий интерферон alpha; в Российской Федерации он выпускается под заглавием «реаферон». За эту работу группа ученых удостоена Ленинской премии.

Сегодня это практически единственный продукт, который эффективен против вирусных гепатитов как в острой, так и в хронических формах, против герпеса, простудных болезней. Интерферон применяется и в терапии некоторых видов рака. За рубежом с 1994 г. выпускаются препараты betta и gamma - интерферонов человека [3].

 

2 Особенности получения интерферонов

 

Разработка методов  получения лейкоцитарного и рекомбинантного  интерферона в препаративных  количествах, а также высокоэффективных  методов их очистки открыла возможность  применения этих препаратов в лечении  вирусных гепатитов. В настоящее время, как в России, так и за рубежом выпускаются коммерческие препараты: человеческий лейкоцитарный, лимфобластный «Велферон» (Wellferon), фибробластный (Ферон); интерферон и интерфероны, полученные генно-инженерными методами: рекомбинантные альфа-(Роферон, Реальдирон, Виферон, Гриппферон и другие), бета- и гамма-интерферон (Гаммаферон). Различные виды интерферона представлены на рисунке 1.

 

Человеческий интерферон-α	Человеческий интерферон-β	Человеческий интерферон-γ

                          

                         Рисунок 1 – Виды человеческого интерферона

 

2.1 Технология  получения лейкоцитарного интерферона

 

Известны способы получения  лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами (рисунок 2).

 

 

 

Основным недостатком  этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.

        

         Способность лейкоцитов человека продуцировать интерферон была показана вскоре после открытия системы интерферона Айзексом /Франция/.

Сущность данной методики заключается в следующем: из периферической крови доноров выделяют лейкоцитарную  массу и подвергают культивированию  в суспензии. Используют питательную среду, в которую добавляют 0,0015 ед/мл инсулина и 100-200 ед/мл нативного интерферона. К лейкоцитам в концентрации (5-10)×10⁶ клеток/мл в качестве индуктора добавляют вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 10⁸/мл ТЦД₅₀ в культуре куриных фиброластов. Продуцированный интерферон отделяют от культуральной среды путем центрифугирования.