Свойства ферментов

 

Рис. 9 Кривая уравнения Михаэлиса-Ментен: гиперболическая зависимость начальных скоростей катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата.

Пользоваться графиком, построенным в прямых координатах зависимости начальной скорости реакции v0 от начальной концентрации субстрата [S0], неудобно, поскольку максимальная скорость Vmaxявляется в данном случае асимптотической величиной и определяется недостаточно точно.

      Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Хол-дейна по методу двойных обратных величин исходя из того принципа, что если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также будут равны. В частности, если

или

то после преобразования получаем уравнение:

которое получило название уравнения Лайнуивера–Бэрка.

 

Рис. 10 График Лайнуивера-Бэрка.

Это уравнение прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах 1/v (y) от l/[S] (x), то получим прямую линию (рис. 10), тангенс угла наклона который будет равен величине Km/Vmax; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, представляет собой l/Vmax(обратная величина максимальной скорости). Если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на абсциссе отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/Кm (см. рис. 10). Таким образом, величину Кm можно вычислить из данных наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных значений.

Следует подчеркнуть, что значения Vmax, как и величину Кm, более точно, чем по графику, построенному в прямых координатах, можно определить по графику, построенному по методу двойных обратных величин. Поэтому данный метод нашел широкое применение в современной энзимологии. Предложены также аналогичные графические способы определения Кm и Vmaxв координатах зависимости v от v/[S] и [S]/v от [S].

     Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Михаэлиса–Ментен, обусловленные множественными формами ферментов и аллостерической природой фермента. В этом случае график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата (кинетическая кривая) имеет не гиперболическую форму, а сигмоидный характер (рис. 11) наподобие кривой насыщения гемоглобина кислородом.

Рис. 11 Сигмоидная кинетическая кривая насыщения субстратом.

Это означает, что связывание одной молекулы субстрата в одном каталитическом центре повышает связывание субстрата с другим центром, т.е. имеет место кооперативное взаимодействие, как и в случае присоединения кислорода к 4 субъединицам гемоглобина. Для оценки концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, в условиях сигмоидного характера кинетической кривой обычно применяют преобразованное уравнение Хилла:

где К' – константа ассоциации; n – число субстрат-связывающих центров.

    

     3.2  Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. С повышением температуры среды скорость ферментативной реакции увеличивается, достигая максимума при какой-то оптимальной температуре, а затем падает до нуля. Для химических реакций существует правило, что при повышении температуры на 10°С скорость реакции увеличивается в два-три раза. Для ферментативных реакций этот температурный коэффициент ниже: на каждые 10°С скорость реакции увеличивается в 2 раза и даже меньше. Наступающее вслед за этим снижение скорости реакции до нуля свидетельствует о денатурации ферментного блока. Оптимальные значения температуры для большинства ферментов находятся в пределах 20 - 400С. Термолабильность ферментов связана с их белковым строением. Некоторые ферменты денатурируют уже при температуре около 400С, но основная часть их инактивируется при температурах выше 40 - 500С. Отдельные ферменты инактивирует холод, то есть при температурах, близких к 0°С, наступает денатурация.

 

 

Рис. 12 Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от температуры.

Повышение температуры тела (лихорадочное состояние) ускоряет биохимические реакции, катализируемые ферментами. Нетрудно подсчитать, что увеличение температуры тела на каждый градус повышает скорость реакции примерно на 20%. При высоких температурах около 39-40°С расточительное использование эндогенных субстратов в клетках больного организма обязательно требуется восполнять их поступление с пищей. Кроме того, при температуре порядка 40°С часть весьма термолабильных ферментов может денатурироваться, что нарушает естественный ход биохимических процессов.

Низкая температура вызывает обратимую инактивацию ферментов вследствие незначительного изменения его пространственной структуры, но достаточного для нарушения соответствующей конфигурации активного центра и молекул субстрата.

    

     3.3  Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды. Для большинства ферментов имеется определенное значение рН, при котором их активность максимальна; выше и ниже этого значения рН активность этих ферментов уменьшается. Однако не во всех случаях кривые, описывающие зависимость активности фермента от рН, имеют колоколообразную форму; иногда эта зависимость может выражаться также прямой. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН главным образом свидетельствует о состоянии функциональных групп активного центра фермента. Изменение рН среды влияет на ионизацию кислых и основных групп аминокислотных остатков активного центра, которые участвуют или в связывании субстрата (в контактном участке), или в его превращении (в каталитическом участке). Поэтому специфическое влияние рН может быть вызвано или изменением сродства субстрата к ферменту, или изменением каталитической активности фермента, или обеими причинами вместе.

Большинство субстратов имеют кислотные или основные группы, поэтому рН влияет на степень ионизации субстрата. Фермент предпочтительно связывается или с ионизированной, или с неионизированной формой субстрата. Очевидно, при оптимальном рН и функциональные группы активного центра находятся в наиболее реакционноспособном состоянии, и субстрат находится в форме, предпочтительной для связывания этими группами фермента.

Рис. 13 Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от рН среды.

При построении кривых, описывающих зависимость активности фермента от рН, измерения при всех значениях рН обычно проводят в условиях насыщения фермента субстратом, поскольку величина Km для многих ферментов изменяется с изменением рН.

     Кривая, характеризующая зависимость активности фермента от рН, может иметь особенно простую форму в тех случаях, когда фермент действует на электростатически нейтральные субстраты или субстраты, у которых заряженные группы не играют существенной роли в каталитическом акте. Примером таких ферментов служит папаин, а также инвертаза, катализирующая гидролиз нейтральных молекул сахарозы и сохраняющая постоянную активность в интервале рН 3,0-7,5.

     Значение рН, соответствующее максимальной активности фермента, не обязательно совпадает со значением рН, характерным для нормального внутриклеточного окружения этого фермента; последнее может быть как выше, так и ниже оптимума рН. Это позволяет предположить, что влияние рН на активность фермента может быть одним из факторов, ответственных за регулирование ферментативной активности внутри клетки. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов, и каждый из них по-разному реагирует на изменение рН, значение рН внутри клетки является, возможно, одним из важных элементов в сложной системе регуляции клеточного метаболизма.

 

     3.4  Активация ферментов. Регуляция ферментов может осуществляться путем взаимодействия с ними различных биологических компонентов или чужеродных соединений (например, лекарств и ядов), которые принято называть модификаторами или регуляторами ферментов. Под действием модификаторов на фермент реакция может ускоряться (активаторы) или замедляться (ингибиторы).

     Активация ферментов определяется по ускорению биохимических реакций, наступающему после действия модификатора. Одну группу активаторов составляют вещества, влияющие на область активного центра фермента. К ним относятся кофакторы ферментов и субстраты. Кофакторы (ионы металлов и коферменты) являются не только обязательными структурными элементами сложных ферментов, но и по существу их активаторами.

     Ионы металлов бывают довольно специфичными активаторами. Часто для некоторых ферментов требуются ионы не одного, а нескольких металлов. Например, для Na+, K+-АТФазы, осуществляющей транспорт одновалентных катионов через клеточную мембрану, необходимы в качестве активаторов ионы магния, натрия и калия. Активация с помощью ионов металлов осуществляется по разным механизмам. В некоторых ферментах они входят в состав каталитического участка. В ряде случаев ионы металлов облегчают связывание субстрата с активным центром фермента, образуя как бы своеобразный мостик. Нередко металл соединяется не с ферментом, а с субстратом, образуя металлосубстратный комплекс, который предпочтителен для действия фермента.

     Специфичностью участия коферментов в связывании и катализе субстрата объясняется активация ими ферментативных реакций. Особенно заметно активирующее влияние кофакторов при действии на фермент, который не насыщен кофакторами.

     Субстрат тоже в известных пределах концентраций является активатором. После достижения насыщающих концентраций субстрата активность фермента не возрастает. Субстрат повышает стабильность фермента и облегчает формирование нужной конформации активного центра фермента. Ионы металлов, коферменты и их предшественники и активные аналоги, субстраты можно использовать на практике как препараты, активирующие ферменты.

     Активация некоторых ферментов может осуществляться путем модификации, не затрагивающей активный центр их молекул. Возможно несколько вариантов такой модификации: 1) активация неактивного предшественника - профермента, или зимогена. Например, превращение пепсиногена в пепсин; 2) активация путем присоединения какой-либо специфической модифицирующей группы к молекуле фермента; 3) активация путем диссоциации неактивного комплекса белок - активный фермент.

 

     3.5 Ингибирование ферментов. Существуют реагенты, способные взаимодействовать более или менее специфично с той или иной боковой цепью белков, что приводит к ингибированию активности фермента. Это явление позволяет изучать природу аминокислотных боковых остатков, принимающих участие в данной ферментативной реакции. Однако на практике следует учитывать многочисленные тонкости, делающие однозначную интерпретацию результатов, полученных со специфическими ингибиторами, довольно трудной и зачастую сомнительной. Прежде всего, чтобы реакция с ингибитором подходила для изучения природы участвующих в реакции боковых цепей, она должна удовлетворять следующим критериям: 1) быть специфичной, т.е. ингибитор должен блокировать только нужные группы; 2) ингибировать активность фермента, и это ингибирование должно становиться полным при увеличении числа модифицированных групп; 3) реагент не должен вызывать неспецифическую денатурацию белка.

     Выделяют 2 группы ингибиторов: обратимого и необратимого действия. В основе подразделения лежит критерий восстановления активности фермента после диализа или сильного разведения раствора фермента с ингибитором.

     По механизму действия выделяют конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное, субстратное и аллостерическое ингибирование.

     3.5.1 Конкурентное ингибирование. Конкурентное ингибирование было открыто при изучении ингибирования, вызываемого аналогами субстрата. Это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием с активным центром фермента ингибитора сходного по структуре с субстратом и препятствующего образованию фермент-субстратного комплекса. При конкурентном торможении ингибитор и субстрат, будучи сходными по строению, конкурируют за активный центр фермента. С активным центром связывается то соединение молекул, которого больше.

     Такие представления о механизме ингибирования были подтверждены экспериментами по кинетике реакций конкурентного ингибирования. Так, было показано, что в случае конкурентного ингибирования аналог субстрата не влияет на скорость разложения уже образовавшегося комплекса фермент-субстрат, т.е. при использовании «бесконечно большого» избытка субстрата получается одна и та же максимальная скорость как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора. Напротив, ингибитор влияет на величину константы диссоциации и константы Михаэлиса. Из этого можно сделать вывод, что ингибитор реагирует с группами белка, участвующими тем или иным образом в связывании субстрата, следовательно, из-за взаимодействия его с этими группами прочность связывания субстрата уменьшается (т.е. уменьшается число молекул фермента, способных связывать субстрат). Позже было показано, что кинетически конкурентное ингибирование может быть вызвано не только аналогами субстратов, но и другими реагентами, химическая структура которых абсолютно отличается от структуры субстрата. В этих случаях также предполагалось, что данный реагент взаимодействует с группой, ответственной за связывание субстрата.

     Для конкурентного ингибирования теоретически могут существовать две возможности: 1) связывающие и каталитические центры фермента перекрываются; ингибитор связывается с ними, но влияет только на группы центра связывания; 2) центр связывания и каталитический центр в молекуле фермента пространственно обособлены; ингибитор взаимодействует с центром связывания.

     Существуют следующие элементарные стадии реакции: где I - ингибитор, а KI - константа диссоциации комплекса фермент - ингибитор.

Относительная скорость (отношение скорости ферментативной реакции, измеренной в присутствии ингибитора (vi), к максимальной скорости) равна