Трансплантация эмбрионов

В случае скрытой охоты  или невозможности установить точное время начала охоты у донора осеменение проводят 56-82 ч. после инъекции простагландина.

День, в который проводится искусственное осеменение животных-донора, считается датой оплодотворения. С этого дня, который в биотехнологии  трансплантации животных обозначается нулем, начинается отчет развития эмбрионов  до их извлечения.

Эффективность искусственного осеменения коров-доноров в суперовулирующую охоту во многом зависит от правильности выбора оптимального времени для  осеменения коров с учетом таких  особенностей эструса, как проявление течки, ее интенсивность и длительность, общая реакция возбуждения, охоты  и овуляции, качество используемой спермы быков-производителей, а также  строгого соблюдения ветеринарно-санитарных требований при выполнении работ.

Течка у коров характеризуется  набуханием и покраснением слизистых  преддверия влагалища и шейки  матки, выделением слизи из половых  органов. Длительность течки составляет от 2 до 6 суток. Через 24-36 часов после  начала течки наступает общее  возбуждение, животное теряет аппетит, снижает удой, становится беспокойным, прыгает на других животных. Через 6-12 часов, после того как у коровы появились признаки возбуждения, наступает  охота, которая продолжается 12-18 часов.

У мясного скота продолжительность  течки колеблется в пределах от 21 до 44 часов, охота длится от 7 до 12 часов, овуляция наступает через 20-25 часов  от начала и 10-15 часов после окончания  охоты.

Выявление животных в охоте  проводят не реже трех раз в день при активных прогулках или пастьбе. В суперовулирующий цикл 60-70% коров  приходит в охоту утром, 10% - в полдень  и 20-30% вечером. Продолжительность каждого  наблюдения составляет 1-2 часа. Охоту  считают установленной, если корова не менее двух раз подряд проявила рефлекс неподвижности.

При осеменении необходимо учитывать тот факт, что овуляция наступает через 10-15 часов после  окончания охоты, а яйцеклетки при  выходе из фолликулов в рог матки  способны сохранять жизнеспособность только в течение 5-6 часов, поэтому  осеменять коров следует перед  овуляцией, как можно ближе к  ее началу.

Сроки осеменения коров можно  определить и ректально. За 6-12 часов  до овуляции в яичнике присутствует зрелый фолликул, представляющий собой  пузырек размером 1,5-1,8 см, при осторожном надавливании на который ощущается  зыбление.

Осеменение доноров осуществляют ректоцервикальным способом, позволяющим  контролировать состояние половых  органов самки, дважды в день двойной  дозой спермы в тело матки с  применением стерильных инструментов одноразового пользования. В каждой дозе должно быть не менее 30 млн. подвижных  спермиев. Первое осеменение проводят после установления охоты, второе - через 10-12 часов. При необходимости (длительная охота) осеменение повторяют 3-4 раза. Используется только сперма с  высокой оплодотворяющей способностью и хорошего качества. Иногда для  повышения результативности осеменения используется семя двух быков. Достоверно не известны причины этого. Однако существует мнение, что происходит отбор наиболее жизнеспособных мужских гамет, обладающих высокой оплодотворяющей способностью.

При введении инструмента  в цервикальный канал сперму следует  впрыскивать медленным нажатием на поршень катетера, распределяя  ее равномерно на протяжении всего  канала шейки матки. Допускается  легкий массаж шейки и рогов матки. Для большинства животных мясного скота характерен легковозбудимый тип нервной деятельности. Поэтому, при искусственном осеменении следует создавать спокойную обстановку с целью снятия стрессового воздействия на животное. В случае если донор ведет себя неспокойно, проводят внутримышечную инъекцию 2%-го аминазина из расчета 0,05 г на 100 кг живой массы. После осеменения коров-доноров необходимо выдержать в стойле до прекращения признаков охоты.

Искусственное осеменение коров-доноров  в суперовулирующую охоту является одним из важных факторов, который  оказывает влияние на оплодотворяемость  яйцеклеток и выход полноценных  эмбрионов. Поэтому в этот период за донорами должен вестись строгий  контроль для того чтобы четко  определить начало охоты и ее продолжительность. Нашими исследованиями было установлено, что кратность осеменения оказывает  положительное влияние на эмбриопродуктивность коров-доноров (табл. 3). Оплодотворяемость яйцеклеток при трехкратном осеменении, при этом увеличивается на 6,0%, а выход полноценных зародышей, в расчете на одного донора на – 1,2 эмбриона.

Таблица 3 - Оплодотворяемость  яйцеклеток, количество и качество эмбрионов у коров-доноров в  зависимости от кратности их осеменения 

Показатели	Количество осеменений
	два	три
Число коров – доноров	25	25
Реагировало полиовуляцией	21	22
Среднее число овуляций на донора	11,2	11,8
Положительных по извлечению доноров	21	21
Извлечено зародышей на положительного донора	7,0	7,6
Из них пригодных к пересадке	4,6	5,8
Дегенерированных	1,7	1,5
Неоплодотворенных яйцеклеток	0,7	0,3
Оплодотворяемость яйцеклеток в %	90	96

 

 

3. Сравнительная эффективность разных  способов вымывания эмбрионов  у коров.

3.1 Контроль реакции яичников.

Контроль реакции яичников проводится с целью определения  готовности донора к извлечению эмбрионов, а также для ориентировочного определения возможного количества эмбрионов, что дает возможность  вести контроль за качеством извлечения и планировать дальнейшую работу. Подсчет желтых тел и фолликулов у доноров проводят непосредственно  перед извлечением эмбрионов  путем ректальной пальпации яичников. При этом следует учитывать, что  полноценное желтое тело представляет собой бугорок грибовидной формы  с углублением в центре и твердый  на ощупь. Фолликулы не так резко  выступают над яичником, округлые по форме. При пальпации чувствуется  флуктуация фолликулярной жидкости. У доноров, у которых желтые тела отсутствуют или их насчитывается  не более двух, извлечение эмбрионов  не проводят. 

 

3.2 Хирургические методы.

Самым простым и  надежным способом извлечения эмбрионов  является убой коровы-донора. Этот способ практиковался только на первых этапах освоения метода трансплантации. В настоящее время из-за потери генетически ценной коровы-донора он не используется.

Важным моментом, обеспечивающим эффективность извлечения эмбрионов, является определение стадии их развития и места положения  в половых путях коровы-донора. Для трансплантации рекомендуется  использовать бластоцисты, поэтому  эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками  после первого искусственного осеменения.

Имеется несколько  способов хирургического извлечения эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища, лапаротомия  по белой линии живота и лапаротомия  в области голодной ямки.

Хирургическим способом зародышей  извлекают при общем или местном  обезболивании. Разрезают брюшную  стенку по белой линии или чаще в области голодной ямки справа или  слева, подтягивают рог матки  к поверхности раны, делают разрез вблизи его основания и вставляют  специальный катетер. Затем через  иглу, введенную в полость рога у его верхушки, или через канюлю, вставленную в яйцепровод, вводят специальную среду, которую вместе с зародышами собирают через катетер. При этом методе получают до 70% жизнеспособных зародышей. У коровы можно извлекать  зародышей непосредственно из яйцепровода (в течение первых 4 дней после  осеменения). Но хирургический способ, по мнению многих специалистов, имеет  лишь научное значение. Он трудоемок, требует, больших расходов, и поэтому  его применяют только у мелких животных (овец, коз и др.) после  операции у животного значительно  снижается уровень молочной продуктивности, имеется риск потери высокоценного  донора при общем обезболивании. Его нельзя часто повторять, так  как в послеоперационный период образуются спайки, из-за чего возникают  трудности в извлечении зародышей, а затем могут развиваться  необратимые изменения, приводящие к бесплодию доноров (А.П. Студенцов, 1999).

 

3.3 Нехирургические методы.

Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключается в простоте манипуляций. Для этого не требуется  специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно  в производственных условиях. С селекционной точки зрения, при правильном применении нехирургического способа воспроизводительная  способность доноров не нарушается, что позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров  для получения от них большого числа потомков. Эмбрионы извлекают на 7-й день после осеменения суперовулирующих доноров. Оплодотворение яйцеклеток происходит в яйцепроводе. Образовавшиеся зиготы подвергаются дроблению, и большинство из них у крупного рогатого скота попадают в матку на 4-й день. Зародыши целесообразно извлекать у коров на 7-8-й день после первого осеменения (до освобождения зародыша из прозрачной оболочки). Для извлечения зародышей используют 2 способа: не хирургический и хирургический. При не хирургическом способе извлечения зародыше животных фиксируют в станке. Прямую кишку освобождают от содержимого и проводят тщательное ректальное исследование. Определяют, сколько желтых тел находится в каждом яичнике. Хвост с помощью тесемки фиксируют. Проводят туалет и дезинфекцию наружных половых органов и промежностей. Для прекращения перистальтики прямой кишки эпидурально вводят 10 мл 2%-ного раствора новокаина. Для вымывания зародышей из матки применяют различные инструменты. Используют гибкий одноходовой катетер Фолея с упругим мандреном и надувным баллончиком. Инструмент должен быть стерильным. Сначала катетер вводят во влагалище по верхнему его своду и проводят под ректальным контролем через канал шейки матки в рог матки. Для более полного извлечения зародышей нужно, не травмируя слизистую оболочку, как можно глубже ввести инструмент в рог матки после того как катетер достигнет в роге матки необходимого положения, мандрен удаляют и в баллончик катетера накачивают 10-15 мл воздуха. При этом катетер фиксируется в роге матки и промывная жидкость не вытекает мимо катетера.

Закрепив катетер, промывают  полость рога матки с помощью  шприца Люэра вместимостью 50-60 мл. В  рог матки в зависимости от его величины вводят порциями от 40-60 мл промывной жидкости, затрачивая на промывание каждого рога не более 500 мл. Наполнение матки промывной  средой и степень ее оттока контролируют ректально.

Для более полного извлечения зародышей верхушку рога матки приподнимают и выпрямляют. Некоторые авторы рекомендуют  яйцепровод вблизи верхушки рога матки  осторожно зажать большим и указательным пальцами. При этом предотвращается  поступление в брюшную полость  жидкости, содержащей зародыши. Но практика показывает, что поступление в  брюшную полость жидкости из рога матки отмечается только при наличии большого давления в матке, поэтому яйцепровод можно не зажимать. Перед извлечением катетера следует удалить воздух из баллончика. Таким же образом промывают и второй рог.

В качестве среды для промывания используют фосфатно-буферный солевой  раствор (ФБС) Дюльбекко.

Раствор готовят на тридистиллированной  воде. Первые 4 вещества растворяют 800 мл, а 5-е и 6-е каждый отдельно в 100 мл. в итоге получают три раствора которые автоклавируют, а затем  смешивают. В таком виде их можно  хранить при 4 градусах до 2 недели. Непосредственно  перед употреблением в ФБС  вводят следующие компоненты (в расчете  на один литр): альбумин бычьей сыворотки - 4г; глюкоза - 1г; натрий-пироват - 0,036г; пенициллин - 100 тыс. ЕД.

Собранную в цилиндр промывную  жидкость отстаивают 20-35 мин. при температуре 20-37 градусов, чтобы зародыши опустились на дно, после чего верхний слой удаляют с помощью сифона. Нижний слой жидкости порционно по 20-30 мл для обнаружения зародышей исследуют в больших часовых стеклах или чашках Петри под бинокулярной лупой при 10-50-кратном увеличении. Найденных зародышей при помощи пастеровской пипетки переносят в среду для кратковременного хранения (среда Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка). После оценки зародышей их культивируют при 37 градусах до момента пересадки или оставляют для хранения.

 

 

 

 

 

 

 

4. Приживление эмбрионов при различных  способах пересадки.

После промывания рогов матки  необходимо обнаружить эмбрионы в промывной  среде, сконцентрировать их в небольшом  объеме среды для культивирования, и провести оценку жизнеспособности, то есть подготовить для пересадки  и криоконсервации. Всю работу необходимо провести втечение 1-2 часов, так как  длительные манипуляции снижают  жизнеспособность эмбрионов.

4.1 Стадии развития и  качество эмбрионов в зависимости  от дня извлечения.

Наиболее оптимальное  время для извлечения эмбрионов  является 7 день после искусственного осеменения донора. Реже вымывание  производят на 6 или 8 день. Зародыши, полученные в этот период, лучше приживляются после пересадки, легче переносят  экстремальные условия криоконсервации.

Эмбрионы шестидневного  возрвста представляют ранние морулы, 7 дней – поздние морулы (54,1 %), количество ранних морул уменьшилось до 22,9 %, часть поздних морул перешла  в стадию ранних (15,6 %) и поздних (7,4 %) бластоцист.

На 8 день дальнейшее увеличение числа бластоцист (ранние – 15,6 %, поздние  – 25 %) и уменьшение морул, число поздних  морул уменьшилось до 31,3 %.

Среди эмбрионов 9-го дня  развития 80 % поздних бластоцист.

Наибольшее число качественных, пригодных к пересадке эмбрионов, обнаруживают при их извлечении на 7 и 8 дни – 53,1 % и 57,2 % соответственно. Среди эмбрионов, полученных на 6 и 9 дни, число жизнеспособных эмбрионов 37,5 %  и33,3 % соответственно.