Шпаргалка по "Микробиологии"

Методы окраски бактерий (мазков). Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены. Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.  При простых методах окраски используется лишь одна краска. С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.  При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

Оборудование микробиологической лаборатории. В структуру любой микробиологической лаборатории (бактериологической, риккетсиозной, вирусологической, протозойной, микозной и др.) входят:1. Лабораторные комнаты и боксы для работы в асептических условиях. 2. Автоклавная – специально оборудованное помещение для стерилизации питательных сред, посуды, обеззараживания отработанного материала. 3. Моечная, оборудованная для мытья посуды. 4. Виварий – помещение, предназначенное для содержания лабораторных животных. Лаборатория должна быть обеспечена водопроводом, канализацией, электричеством, боксами с приточно – вытяжной вентиляцией, центральным отоплением и горячим водоснабжением. В лаборатории должны быть раковины для мытья рук персонала и раковины для мытья инвентаря. В лабораторной комнате должен быть оборудован рабочий стол, место для окраски препаратов и микроскопирования. В этой комнате должны быть шкаф, термостат, холодильники, центрифуга, микроскоп, раковина с подводкой горячей и холодной воды, горелки (газовые или спиртовые), светильники. Рабочий стол должен быть покрыт металлическим листом и установлен у окна. На столе размещают горелку, банку с бактериологическими петлями, коробку с предметными стеклами, штативы с пробирками и пипетками, оснащенными грушами, штатив с красителями во флаконах, банка ватой, банка с дезинфицирующим раствором. Шкаф необходим для хранения в нем лабораторной посуды (колбы, чашки Петри, пробирки, пипетки и пр.), сухих питательных сред, реактивов и пр. Около раковины должны находиться сосуд с дезинфицирующим раствором для обработки рук, аптечка с набором предметов для оказания первой медицинской помощи, на стене укреплено электрополотенце.

Возбудители зооантропонозов . Зооантропонозы- группа инфекционных и инвазионных болезней, общих животным и человеку. К зооантропонозам относится множество заболеваний различной этиологии (сибирская язва, сап, бруцеллёз, туберкулёз, бешенство, ящур, лептоспироз, трипаносомоз, эхинококкоз, дифиллоботриоз и др.). При зооантропонозах складываются довольно сложные взаимоотношения между эпидемическим и эпизоотическим процессами. Источником возбудителей зооантропонозов для человека являются прежде всего животные, и в первую очередь те, с которыми человек часто соприкасается в процессе хозяйственной деятельности и в быту: сельскохозяйственные и комнатные животные, грызуны, а также дикие животные — объекты охоты. Многие зооантропонозы характеризуются природной очаговостью.

Пищевое отравление. Токсикозы.  Пищевые отравления — острые, редко хронические заболевания, возникающие в результате употребления пищи, массивно обсеменённой болезнетворными микроорганизмами и их токсинами, либо другими веществами немикробной природы. Микробные: Токсикоинфекции (Энтеропатогенные кишечные палочки, бактерии рода протеус, энтерококки, перфрингенс, бациллы цереус, вибрион парагемолитический, другие условно патогенные микроорганизмы), Токсикозы делятся на: Бактериотоксикозы (Энтеротоксигенные стафилококки, ботулиновая палочка) и Микотоксикозы (Микроскопические грибы: аспергиллы, фузарии, спорынья и др). Немикробные: Отравления продуктами ядовитыми по природе  они делятся на Растительного происхождения (Ядовитые грибы, ядовитые дикорастущие, культурные, сорные растения) и Животного происхождения (Икра маринки, молоки, усача, иглобрюх, некоторые моллюски и др. виды рыбы); Отравления продуктами ядовитыми при определённых условиях делятся на Растительного происхождения (Горькие ядра косточковых плодов, сырая фасоль, проросший картофель) и Животного происхождения  (Печень, икра и молоки налима, щуки и др., мидии, мёд, собранный с ядовитых растений).  Пищевые токсикозы — это заболевания, возникающие при употреблении пищевых продуктов, содержащих токсины бактерий. К этой группе заболеваний относятся стафилококковые токсикозы, ботулизм и микотоксикозы. Стафилококковые интоксикации (токсикозы) различают патогенные и непатогенные. Патогенные стафилококки из рода Staphylocokkus вызывают воспалительные процессы кожи, подкожной клетчатки, носоглотки (ангины, риниты, катары верхних дыхательных путей и др.). Некоторые типы патогенных стафилококков при попадании на пищевые продукты могут вырабатывать энтеротоксин, который вызывает пищевое отравление. В настоящее время установлено шесть серологических типов стафилококковых энтеротоксинов, обозначаемых буквами А, В, С, D, Е, F. Большинство этих бактерий образует золотистый пигмент. Наиболее благоприятной средой для развития стафилококков является молоко. Это подтверждается частотой возникновения интоксикаций, вызываемых молоком и продуктами его переработки. При температуре 35—37°С энтеротоксин образуется в молоке через 5—12 ч, а при комнатной температуре хранения (18—20°С)—через 8—18 ч. Ботулизм- Он относится к наиболее тяжелым пищевым отравлениями. Ботулизм возникает при употреблении пищи, содержащей токсины ботулиновой палочки. Возбудитель ботулизма широко распространен в природе; обитает он в кишечнике теплокровных животных, рыб, человека, грызунов, птиц, кошек, в почве, в иле водоемов и др. Cl. botulum — спороносная палочка, являющаяся строгим анаэробом. Различают шесть типов ботулиновой палочки (А, В, С, D, Е, F). Оптимальные условия развития и токсинообразования ботулиновой палочки создаются при температуре 25— 30°С. Микотоксикозы—это заболевания, возникающие при употреблении продуктов переработки зерна, зараженного токсическими веществами микроскопических грибов. К микотоксикозам относятся эрготизм, фузариотоксикоз и афлотоксикоз.

Пищевое отравление. Токсикоинфекция - острое кишечное инфекционное заболевание, обусловленное употреблением продуктов, в которых накопились вредные микроорганизмы и их яды (токсины). Токсикоинфекции на втором месте по распространенности после ОРЗ. оксикоинфекцию (пищевое отравление) могут спровоцировать сальмонеллы, шигеллы, кишечные палочки, стафилококки, стрептококки, эшерихии, протей, некоторые разновидности клостридий и др. Ботулизм, вызываемый клостридиями ботулизма, относится к токсикоинфекциям (пищевым отравлениям), но рассматривается отдельно в связи с резкими отличиями в течении и высоким риском для жизни. Источник патогенных микроорганизмов в пище – носители и больные люди и животные. При благоприятных условиях микробы размножаются яд возбудителя токсикоинфекции накапливается. Причем зараженные продукты по виду и вкусу ничем не отличаются от доброкачественных. Учет численности КОЕ в воде и других жидкостях: Число микроорганизмов в воде, навозной жиже, огуречном рассоле и других жидких субстратах можно определять различными методами. Если исследование ведут, пользуясь методом питательных пластин, то сначала воду и другие исследуемые жидкости 3 мин хорошо взбалтывают. Затем берут стерильной пипеткой 1 мл жидкости и вносят ее в 99 мл стерильной водопроводной воды. Это — исходное разбавление субстрата в 100 раз. Другой стерильной пипеткой набирают 10 мл исходного разведения и вносят в 90 мл воды, взбалтывают 5 мин и далее готовят методом разведения разные концентрации исследуемой жидкости и определяют число КОЕ (колониеобразующей единицы) в 1 мл.

Микрофлора сгущенного молока с сахаром. Сгущенные молочные консервы с сахаром готовят из пастеризованного молока путем сгущения и консервирования сахаром. В качестве пищевых наполнителей используют какао, кофе, кофейный напиток и др. В процессе производства сырое молоко нагревают до 95-1200С, смешивают с сахарным сиропом при 950С, чтобы обеспечить содержание 41,5-42,0% сахара в готовом продукте, и выпаривают под вакуумом до соотношения сгущенного молока и сахара 2,5: 1 и быстро охлаждают. Содержание сухих веществ в готовом продукте составляет 62,5-64%. Сгущенное молоко с сахаром не является стерильным продуктом. Микрофлора сгущенных молочных консервов с сахаром представлена микрофлорой пастеризованного молока (спорообразующими бактериями родов Bacillus, Clostridium, термоустойчивыми микрококками, молочнокислыми бактериями и др.) и микрофлорой вторичного обсеменения. Наиболее опасными микроорганизмами, влияющими на сохранность сгущенных молочных консервов с сахаром, являются дрожжи, микрококки, микроскопические грибы, спорообразующие бактерии и другие осмофильные микроорганизмы, способные размножаться при высоких концентрациях сахара. Пороками сгущенных молочных консервов с сахаром являются:· Горький вкус, коагуляция вызываются термофильными спорообразующими бактериями. Причиной развития этих микроорганизмов в продукте является длительное пребывание в вакуум-выпарной установке;· Прогорклый и горький вкус, загустевание вызывают микрококки и стафилококки, которые попадают в продукт при несоблюдении санитарно-гигиенических режимов производства и размножаются в процессе хранения. Горький вкус может возникнуть также в результате развития гнилостных бактерий;· Плесневение, образование "пуговиц". Возбудителями этого порока являются микроскопические грибы (например, шоколадно-коричневая плесень рода Catenularia), которые развиваются при наличии кислорода в банках;· Бомбаж банок вызывается осмофильными дрожжами при неправильном хранении продукта. Микробиологический контроль производства Не реже 1 раза в декаду контролируют сырье, направляемое на выработку сгущенного молока с сахаром, какао, кофе. В каждой партии выпускаемых молочных консервов определяют наличие БГКП. КМАФАнМ в готовом продукте и по ходу технологического процесса устанавливают 1 раз в месяц. По микробиологическим показателям сгущенное цельное молоко с сахаром должно отвечать следующим нормативным требованиям: БГКП не допускаются в 1 г продукта, фасованного в потребительскую тару, и 0,3 г продукта, фасованного в транспортную тару. КМАФАнМ не должно превышать значения 2,5х104Кое/г. Общая бактериальная обсемененность сгущенного молока с сахаром и наполнителями должна составлять не более 3,5х104 КОЕ/г. Для всех видов продуктов патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, не допускаются в 25 г. Кроме того, сгущенное молоко с сахаром проверяют один раз в 5 дней на наличие дрожжей и плесеней. Сгущенные молочные консервы следует периодически проверять на содержание протеолитических и липолитических бактерий (например, микрококков). Одновременно с отбором проб для контроля технологического процесса отбирают пробы для контроля санитарно-гигиенического состояния производства.

Учет количества микроорганизмов  в воздухе. Сначала определили кабинеты для исследования. Мы выбрали кабинеты, в которых температура была одинаковой: 19-20 °С, но другие условия разными: наличие цветов, компьютера, площадь помещения. В каждом классе в один и тот же день, после уроков приготовленные чашки Петри (2) разместили в разных местах исследуемых помещений и на 5 мин открывали крышки. При этом микроорганизмы и споры, содержащиеся в воздухе, постепенно осаждались на открытой поверхности агарагара. Через 5 мин чашки закрыли и на крышках отметили, кто и где производил посев. Завернули чашки в бумагу и поместили в теплое место (не менее 20 °С) для инкубации на 7 дней. Через 7 дней подсчитали количество колоний бактерий и грибов в чашках. Если колоний немного, их считают на всей поверхности агарагара чашки Петри. При большом количестве колоний чашку Петри кладут на лист бумаги, разделенный на 4—6 секторов, и считают количество колоний в каждом секторе. При подсчете и рассмотрении колоний рекомендуется использовать лупы. Описание колоний микробов, выросших на питательной среде, проводят по следующим показателям: форма (округлая, неправильная); поверхность (гладкая, блестящая, шероховатая, сухая, складчатая); край (ровный, волнистый, городчатый); цвет; размер (диаметр). Следует отметить, что метод подсчета колоний в чашках Петри с посевом из воздуха дает лишь приблизительные данные. Учитываются лишь микробы быстро оседающей пыли, кроме того, на твердой поверхности агарагара прорастут только аэробные формы микроорганизмов.

Микрофлора стерилизованного молока. Стерилизованное молоко вырабатывают тремя способами: автоклавированием в стеклянных бутылках, комбинированным способом (первая стерилизация в потоке, вторая - в бутылках), одноразовой стерилизацией с последующим розливом в асептических условиях. МИКРОФЛОРА СТЕРИЛИЗОВАННОГО МОЛОКА, ВЫРАБОТАННОГО КОМБИНИРОВАННЫМ СПОСОБОМ : При производстве стерилизованного молока комбинированным способом молоко стерилизуют при 135° С с выдержкой 15-20 с, охлаждают до 20-30° С, затем подогревают до 65-70° С, разливают в узкогорлые бутылки, укупоривают их кронен-корками и повторно стерилизуют в башенном стерилизаторе при 114° С. При освоении и эксплуатации линии производства стерилизованного молока может возникнуть два порока микробиологического происхождения: прокисание и образование горечи. Порок прокисания характеризуется следующими признаками: в отдельных бутылках одной партии молоко свертывается, при этом часто образовывался неровный сгусток с признаками газообразования. Бутылки с испорченным молоком можно легко обнаружить и отсортировать. При микроскопировании обнаруживаются стрептококки и палочки типа молочнокислых, кислотность сгустка была 70° Т и выше. Порок возникает в результате нарушения герметичности укупорки, обусловленной плохим качеством кронен-корок и их загрязнением перед укупоркой. Посторонняя микрофлора попадает в бутылку в последней секции башни, где бутылки обмываются водой при температуре, допускающей развитие микроорганизмов. Порок горечь не сопровождается какими-либо заметными изменениями внешнего вида молока. Порок можно обнаружить лишь при употреблении молока в пищу. Исследуя причины возникновения порока, установлено, что возбудителем его являются термофильные анаэробные споровые палочки типа Вас. stearothermophilus с оптимальной температурой развития 55-60° С. Условия для их размножения создавались в промежуточной емкости, куда молоко поступало после первой стерилизации перед розливом. Споры этих микроорганизмов, оставшиеся после второй стерилизации, прорастали после того, как молоко в ящиках устанавливали плотными штабелями на складе с не регулируемой температурой. Порок проявляется летом, так как в этот период начальная температура молока в бутылках, равная примерно 50° С, сохранялась на этом уровне в течение 6-8 ч. При быстром охлаждении молока перед складированием порок не развивается, так как при этих условиях споры термофильных бактерий не могли прорасти. Исследуя причины возникновения горечи, проведён контроль большого числа проб молока путем термостатирования при 55° С. И было установлено, что при такой температуре более 50% проб молока были нестерильными. Этот метод позволял обнаружить видимые изменения в 14,8% образцов молока (Г. Бартон, Дж. Пиен и Г. Тиеулин, 1972). Фактически же при умеренных температурах хранения продукта не наблюдается изменений внешнего вида, вкуса и рН. Это обстоятельство подтверждает высказанное ранее мнение, что при производстве стерилизованного молока важно не только соблюдать условия абсолютной стерильности, но и не допустить развития оставшихся бактерий или их спор при последующем хранении. МИКРОФЛОРА СТЕРИЛИЗОВАННОГО МОЛОКА, ВЫРАБОТАННОГО ОДНОСТУПЕНЧАТЫМ СПОСОБОМ С ПОСЛЕДУЮЩИМ РОЗЛИВОМ В АСЕПТИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ: При этом способе молоко стерилизуют непосредственным введением пара при 140-150° С или в стерилизаторах с поверхностным обогро-вом при 130-140° С. Затем молоко охлаждают до 20° С и разливают на линии асептического розлива в бумажные пакеты. Причины возникновения пороков микробиологического происхождения на линиях производства стерилизованного молока, укомплектованных установками ВТИС (пароконтактный метод стерилизации) и автоматами "Тетра-Пак-Асептик" для асептического розлива, были подробно изучены В.С. Лешиной (1971). Продукты с пороками характеризовались повышенной кислотностью (60-70° Т) и наличием плотного сгустка, иногда горьким вкусом, отсутствием сгустка или наличием признаков пептонизации молока. В первом случае при микроскопировании в препаратах обнаруживалась смешанная микрофлора с преобладанием молочнокислых стрептококков, во втором - наличие споровых палочек. Пороки чаще наблюдались весной и летом. В результате систематического контроля производства путем отбора молока из буферного танка в контрольную колбу и через каждые 30 мин работы по 2 пакета с каждого упаковочного автомата с последующим термостатиро-ванием образцов при 37° С были выявлены следующие наиболее типичные нарушения: режимов стерилизации; режимов мойки и дезинфекции оборудования на линии асептического розлива; герметичности в асептической части установки ВТИС или на линии асептического розлива до упаковочных автоматов; условий асептики на упаковочных автоматах, некачественная обработка бумаги. На основании данных повседневного контроля нельзя определять средний процент брака стерилизованного молока, вырабатываемого на конкретной линии, так как в этом случае количество отбираемых проб слишком мало для статистической обработки. При инкубировании 35310 образцов асептически упакованного молока свертывание его наблюдалось в 36 пакетах, еще в 2 пакетах было обнаружено изменение вкуса и запаха (Г. - Ромагноли, Г. Брецци, 1970). Органолептические результаты согласовывались с микробиологическими, на основании чего был сделан вывод о нецелесообразности микробиологического контроля стерилизованного молока. Делаются попытки повысить стойкость питьевого молока путем его стерилизации, но с последующим розливом в неасептических условиях. По данным Энона (1969), молоко, подвергнутое УВТ-стерилизации, хранили в танках при 0°С в течение 3-4 недель, затем повторно пастеризовали, упаковывали и хранили при О, 1, 4,5 и 5° С. При этом качество большинства образцов сохранялось более 10 недель, отдельных - до 23 недель. В Японии молоко обрабатывают при 120-135° С и упаковывают в обычные бутылки без соблюдения асептики (Р. Ханзен, 1970). Однако при использовании такой технологии требуется исключительно высокая санитарная культура производства, при которой вторичное обсеменение молока после пастеризации сводится к минимуму. Работа, проведенная А. Эйрардом и Т. Одэт (1966), показала, что разница в сроках хранения молока, пастеризованного и стерилизованного, разлитого на обычных линиях, сравнительно невелика и не позволяет создать новый вид питьевого молока. Стерилизация оказывается совершенно неэффективной при низком уровне санитарно-гигиенической обработки оборудования и недостаточном охлаждении молока.

Техника посева. Посев — один из стационарных методов культивирования микроорганизмов на питательных средах, применяемый для культуральной диагностики в медицинской микробиологии, а также для исследования биохимических и биологических свойств в различных биотехнологических целях. В зависимости от содержания исследуемых бактерий в образце, проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний и определения чистоты культуры). Если в исследуемом материале содержание микроорганизмов незначительное, то посев проводят на жидкие среды обогащения. ТЕХНИКА ПОСЕВА: Для посевов применяют микробиологические петли, реже — иглы и шпатели. Чаще всего для культивирования используются пробирка и чашка Петри. Универсальным инструментом для засева культуры является бактериальная петля. Помимо неё, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлёй используются градуированная и пастеровская пипетки. ПОСЕВ НА ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ (В ПРОБИРКЕ): При посеве берут пробирку в левую руку, а правой, плотно обхватив пробку четвёртым и пятым пальцами, вынимают её. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, в вертикальном положении её вносят в открытое пламя и прожигают до красного каления. Остывшей петлёй набирают посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой, предварительно пронося её над пламенем спиртовки. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская её до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают её пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив рукояткой вниз. Пробирки с посевами подписывают заранее, указывая дату посева, номер исследования и название культуры. ПОСЕВ НА ТВЁРДЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ (В ЧАШКЕ ПЕТРИ): Посевы «газоном» производят на плотную питательную среду в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлёй или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара по методу Дригальского. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий с разделением их на колонии. Идентификацию выделенных бактериальных культур проводят путём изучения морфологии бактерий, их культуральных, биохимических и других признаков, присущих каждому виду.

Культивирование микроорганизмов. Культивировать микроорганизмы – это значит искусственно создавать условия для их роста и размножения in vitro (это технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» — вне живого организма) , взаимосвязанных, но не обязательно сопряжённых процесса. Рост и размножение –циклический 4-х фазный  процесс (латентная, логарифмического роста, стационарная, гибель). Период между образованием новых клеток и их делением называется периодом генерации, на длительность которого, кроме особенностей микроба, влияет состав питательной среды. Формы колоний разных микробов на питательной среде одного и того же состава отличаются, что учитывают при их дифференциации. Для культивирования  in vitro  необходимы субстраты, которые микроорганизмы могут использовать  в качестве питательных веществ для своего роста и размножения. Такие питательные субстраты – плотные или жидкие – называют культуральными или питательным средами. В большинстве случаев в микробиологических лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных колбах, пробирках и других сосудах.К любой питательной среде предъявляют ряд основных требований:1). Стерильность и по возможности прозрачность.2). При составлении питательных сред  учитывают потребность микроорганизмов в элементах питания (необходимые для жизнедеятельности клеток биохимические факторы – источники энергии, С, N, S, а также неорганические ионы – доступные для усвоения микроорганизмами).3). Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (pH), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (aw), осмотического давления.