Фармацевтикалық және медициналық өнеркәсіптеріндегі биотехнология

(колбада) сұйық  қоректік  орта тербелмелі   шайқағышта (бір-екі сатылы)        (бір немесе бірнеше инокуляторда) егіс аппаратында өсірілген кіші ферментерде микроорганизм культурасының жиналуы         егіс материалы.

Егіс материалды өсіру  келесі сатыларда жүргізіледі:

1-зауыттың микробиологиялық  лабораториясында  микроорганизм     

     культурасын   алу; 

2 - егіс материалын  кіші егіс аппаратта өсіру  ( сиымдылығы 300 литрлік ) ;

3 - ашытқыны үлкен егіс  аппаратта өсіру (сиымдылығы 3200 литр);

4- кіші ферментерге  ашытқы культурасының жиналуы(сиымдылығы 50м³).

Егіс материалын өсірудің бірінші сатысы зауыттың лабораториясында жүргізіледі. Бастапқы культура зарарсызданған жолмен қисық агарланған ортада оптимальды қоректік ортада, режимде (рН, t , процес  ұзақтығы) өсіріледі. Өсірілген микроорганизм культурасының агарланған қоректік ортасының бетін зарарсызданған сумен шайып оны, ішінде 50-100мл сұйық қоректік ортасы бар cыйымдылығы 750 мл Эрленмейер колбасына құяды . Культурасы бар колбаны (28-30°С) бөлме температурасымен тербелмелі шайқағышқа қояды , культураны араластыру тербелгіште (120-240 айн/мин) орындалды, культураның қарқынды өсу жылдамдығының арқасында масса алмасу жоғарылайды. Тербелмелі шайқағышта колбаның ішіндегі культураның өсу мерзімі 18-36 сағатқа созылады. Бұл сатыда микроорганизмнің морфологиясы бойынша микроорганизмнің өсіруін бақылайды. Логарифмдік өсу фазасының соңында культураның физиологиялық жетілген сатысы  нәтижелі  болады.

Екінші сатыда егіс материалдың дайын культурасын өсіру, колбадан егіс аппаратына (инокуляторға) зарарсызданған күйде ауыстырылады, осыған қайта – қайта минералды тұздарды белгілі мөлшерде қосып отырады. Егіс аппарат араластырғышпен, аэрирлеуші қондырғымен, сонымен қатар температурасын, рН, бақылау - өлшегіш аспаппен, көбік деңгейін реттеушімен және тағы басқада қондырғылармен жабдықталады. Аппараттағы қоректік орта көлемінің деңгейі жалпы аппарат көлемнің 60% аспауы керек. Егіс материалының аппаратқа салынған мөлшері жоғарғы мәнге ие. Аз мөлшердегі егіс материал, инокуляцияның ұзақ уақыт жүруін болдырады. Сондықтан егілетін аппаратқа қоректік орта көлемінен егіс материалының 10-12% ғана салады. Егіс материалын дайындау кезінде аппаратта культивирлеудің оптимальды режимін ұстау керек.  Процесті бақылау жасау үшін, қайта – қайта сынамалар алынып   оған микробиологиялық және биохимиялық анализдер жасалынады. Ашытқы

 

 

қоректік ортада 14-20 г/л  жиналғанша культивирлеу процесі жалғаса береді (есеп бойынша құрғақ массада)  культивирлеу процесі  12-14 сағатта аяқталады.

Үшінші саты көлемі 3,2м³ болатын егіс аппаратында егіс материалын культивирлеу процесі жүргізіледі. Ол үшін кіші инокулятордағы барлық құрам бөлігін үлкен көлемді аппаратқа айдап жіберіледі. Сол жерде зарарсызданған қоректік орта бар. Ауысу коэффициенті, бір аппараттан басқа аппаратқа ауысуы микроорганизмнің әрбір культурасын өсірудің нақтылы шартына байланысты. Егерде бұл ауысу экспоненциальды өсу фазасында іске асырылса, онда ауысу коэффициенті келесі аппараттың көлеміне қарағанда 10-ға тең. Микроорганизм культурасын культивирлеу процесі 12-14 сағатқа созылады.

Төртінші саты көлемі 50м³ болатын аппаратта жүргізіледі. Ашытқы суспензияларын алдынғы сатыдан қабылдар алдында, қоректік ортаны аппарата дайындау үшін парафинді, қоректік тұздардың ертіндісін және микроэлементтерді аппаратқа жібіреді. Ортаның оптимальды рН мәнін , температурасын жеткізеді, егістік ашытқыларды келесі сатыға жібереді және  үздіксіз аэрациялау мен арастырудың арқасында микроорганизмді өсіру процесі жүргізіледі. Ашытқының жиналу процесі 10-12 сағатқа созылады. Абсолютті құрғақ ашытқы концентрациясы ортада 14-17 г/л құралғанда, ашытқы суспензиясы өндіріс ферментатерлеріне жіберіледі. Алынған егіс материалына микробиологиялық және биохимиялық бақылау жасалынады, демек келесі сатыда  өнімділігінің жоғары болуы, циклдің тазалығы мен активтілігіне байланысты.

 

Жұмысты орындау  әдісі  

Материалдар және құрал жабдықтар 

 Термостат, микробиологиялық  ілмешек, колбаны тербелткіш, қыздырғыш,  микроорганизмнің таза культурасы,ЕПА  бар қисық(косяк) пробирка, сусла  агар, ет-пептонды агар.

 

Жұмыстың орындалуы

 

Таза культураны сусла агарда және ЕПА-да қисық  пробиркада (косякта) егу әдісі

 

• Пробиркада жаңадан жасалған қоректік ортада микроорганизмнің аты және егілген күні түсінікті етіліп жазылады. Жазуды сиямен немесе стеклографит қарандашпен жазады.
• Спритовканы жағады, жанып тұрған горелканың үстінде микроорганизмді егу жүргізіледі, қоршаған ортадағы ауаға ыстық ауа қарсы бола алады.
• Оң қолымен бактериологиялық петляны алып, соның көмегімен егу, іске асырылады петляны қалам сияқты ұстайды.
• Жанған оттың үстінде бактериологиялық петляның сымы қызыл шоқ болғанға дейін қыздырылып зарарсыздандырылады және ұстап тұрған жеріндегі петляның ұшындағы сымы пробиркадағы микроорганизмнің таза культурасына енгізілетін жеріне дейін қыздырылып зарарсыздандырылады. Сол қолымен екі пробирканың біреуі зарарсыздандырылған ортамен (өзінен алыс) келесісі-микроорганизм культурасымен (өзіне жақын ) ұстайды .
• Оң қолымен бактериологиялық петляны ұстап, шынтағымен және оң қолының бармағымен мақта тығынды қысып алып алақанына саладыда және пробирканың тығынын алады, және столдың үстіне пробирканы қоюға болмайды.
• Аузы ашылған пробирканы жанған отқа жәймен күйдіріп, бактериологиялық петлямен микроорганизмдердің таза культурасын пробиркаға енгізеді. Микроорганизмдердің жасушасын бүлдіріп алмау керек, пробирканың бетіне жақындатар алдында немесе қоректік ортаға жақындатар алдында петляны суытады, содан соң микробтың аз ғана мөшерін алады.
• Петляны алып, зарарсыздандырылған пробиркадағы қоректік ортадаға, пробирканың жақындатпай петляны енгізеді.
• Бактериологиялық петляның көмегімен культурасы бар пробиркадан ирек немесе тік сызық-сызық сияқты етіп олардың бетіне жәймен түбінен жоғарыға қарай жүргізіп , культураны қоректік ортаға егеді.
• Мақта тығынымен пробирканың аузының шеттерін отқа күйдіріп және екі пробирканың аузын жабады.
• Бактериологиялық петляны жалында күйдіреді. Осындай операциялар агарланған ортамен басқа пробиркаларда да жүргізіледі.

 

Егіс материалын колбадағы сұйық қоректік ортаға егу.

        Тербелгіш колбадағы беті агарланған ортада өскен культурасы бар пробирканы зарарсызданған сумен жуып, сұйық қоректік ортаға 50-100мл құрайды (ЕПС). Культурасы бар колбаны жылдамдығы (240айн/мин) тербелгішке орналастырады. Культивирленетін бөлменің температурасы 30⁰С  тең болуы керек. Өсірілетін культураның түріне байланысты өсіру процесінің ұзақтығы 0,5-3 тәулікке дейін созылады. Ферментация процесінде микроорганизмнің морфологиялық түрінің көрсеткішіне қарай бақылау керек.

 

   Бақылау  сұрақтар:

1. Егіс материал дегеніміз не?

2. Егіс материалын дайындаудың қандай сатысы маңызды?

3. Культура продуцентінің құжатына қандай мәліметтер кіреді?

4. Егіс аппаратына егіс материалының қанша мөлшері енгізіледі?

5. Жұмыстың жасалу барысы? 

 

 

 

 

 

 

 

 

№ 5 зертханалық  жұмыс

Микроорганизмдерді  культивирлеу. Сандық сипаттамасы және

негізгі әдісі (4 сағат)

 

Жұмыстың мақсаты: Микроорганизмді периодты және үздіксіз культивирлеудің теориялық негізімен және процестің сандық сипаттамасымен, бактерияның өсуіне аэрацияның әсерімен танысу.Микроорганизмнің дамуына сыртқы әсер ететін факторды зерттеу.

 

Теориялық негіздері

Микроорганизмдерді культивирлеу әдістері биотехнологиялық синтез технологиясы микроорганизмдер – продуцентінің қасиетіне қарай құрастырылады . Микроорганизмнің осы түрі үшін жағдайының жақсы болуы, тек өмір сүруіне қолайлы жағдай жасап, максимум  мол өнім алуға мүмкіндік береді және синтездей алады. Микроорганизм – продуцентін өсіру үшін, культивирлеудің беттік және түптік әдісі қолданылады .

Микроорганизмдерді беттік әдіспен өсіру технологиясы қарапайым  болып келеді. Микроорганизмдер қатты немесе сұйық қоректік  ортада  культивирленеді. Қатты қоректік орта ретінде агарланған орталар немесе сусымалы субстраттар (бидай, арпа, бидай кебегі және т.б.) қолданылады. Агарланған қоректік орталарды зарарсыздандырып пробиркаға, Петри табақшасына құйылады. Культура  продуцентін қоректік ортаға еккеннен кейін пробирка мен Петри табақшасымен термостатқа қойылады, онда микроорганизмдердің белгілі бір температурада өсуі мен дамуы жүреді. Сусымалы   субстратты біркелкі етіп арнайы кюветаларға орналастырады, егіс материалын салғаннан кейін өсіру камерасына қойылады. Микроорганизмдерді қолайлы жағдайда өсіру бірнеше күнге созылады. Микроорганизмдерді өсіру процесі аяқталған соң дайын өнім бөліп алынады. Беттік әдіспен микроорганизмдерді өсіру процесі белгілі бір уақытта аяқталады, сондықтан ол периодты болып саналады.

Арнайы аппарат–ферментерде  сұйықтықтың барлық көлемінде қоректік ортада микроорганизмдерді түптік әдіспен өсіру жүргізіледі. Микроорганизмдерді түптік әдіспен өсіру периодты және үздіксіз болуы мүмкін. Периодты әдіспен түптік культивирлеу процесінде ферментерге бірден барлық қоректік орта және егіс материалының барлық көлемі салынады.  Белгілі бір уақыт ішінде микроорганизмдерді өсіру қолайлы жағдайда жүргізіледі, кейде процесті тоқтатып ферментерден керегінше құйып алынып, дайын өнім бөліп алынады. Микроорганизмді өсіру үшін қолайлы жағдай жасалып, түптік культивирлеудің үздіксіз әдісі кезінде қоректік орта үздіксіз ферментерге келіп түсіріледі қосылады, ол ферментерден сондай-ақ культуралды сұйықтықтан  микроорганизмдермен бірге үздіксіз ағылып  шығарылып отырады.

Микроорганизмдердің периодты және үздіксіз процесі кезінде өсу  жағдайы әртүрлі екендігі белгілі. Периодты процесс кезінде қоректік заттардың концентрациясы уақыт өткен мерзімде қоректік ортада азаяды, ал азықтық метаболизм құрамы көбейеді, ол микроорганизмдердің өмір сүруіне кері әсерін тигізеді. Үздіксіз процесс кезінде микроорганизмдердің өсуіне қолайлы жағдай жасалады, бұл екі көрсеткіш үнемі бірдей деңгейде болады .

 

       Микроорганизмдерді периодты түрде  культивирлеу

Егіс материалын алу  барысында көбінесе культивирлеудің  периодты әдісі қолданылады. Микроорганизмді  культивирлеу кезінде компоненттер қоректік ортаға келіп түспей және одан шықпай тұрған кезде микроорганизмдер өсіріледі және көбейеді. Белгілі даму циклы өткен соң,  фазаның ауысқаны көрсетіледі, осы жағдайда микроорганизм өседі және көбейеді. Тізбектеле ауысу фазалары графикалық түрде көрсетілуі мүмкін. Сосудта жасушаның саны егіс материалын еккен кезден бастап анықталса, әрбір уақыт мерзімі белгіленіп, абсцисса осіне жіберіледі,  жасушаның белгілі санына сәйкестеліп ординат осіне жіберіледі (сурет). Бұл қисықты микроорганизмдердің өсу қисығы деп атайды және бірнеше фазаларға немесе периодтарға бөледі.

І фаза лаг-фаза немесе бейімделу фазасы деп аталады.Мұнда жаңадан жасалған қоректік ортаға жіберілген микроорганизмдер көбеймейді, қайта бейімделеді. Бұл фаза 1-2 сағатқа созылады. Фаза аяқталған кезде жасуша көбейе бастайды. Қоректік ортаны пайдалану қуатты түрде жүреді. Микроорганизмдер көбейгенге дейін қоректік орта инокулятқа енгізген уақыттан басталады. Бұл периодта культура жаңа ортаға  бейімделеді, бұл фазаның ұзақтығы микроорганизмдердің физиологиялық ерекшелігіне байланысты және  культивирлеу жағдайына, егіс материалына және өндірістік орта құрамына  байланысты. Мұндай  айырмашылық аз болған сайын және егілетін микроорганизмдердің мөлшері неғұрлым көп болса, онда І фазаның өсуі соғұрлым  қысқа болады.

Қандайда бір өзгеріске  ұшырауына қарамастан жасуша ішінде бірқатар биохимиялық өзгерістер болады. Жасушада рибосома саны және ақуыз құрамы көбейеді, ферменттік жүйелер активтеледі. Алдымен периодта популяция саны көбеймейді, бірақ жасушаның көлемі жоғарылайды.

ІІ фаза Өсу жылдамдығының фазасы немесе ауыспалы деп аталады. Бұл жасушаның бөліне бастауы болып сипатталады. Бұл сатыда жасушадағы  нуклеин қышқылының (ДНҚ, РНҚ) ақуыздың құрамы жоғарылайды, жасушаның көлемі ұлғаяды. Жасуша беті белгілі қатынасы аралық жетістігінің арқасында және оның көлемі  жасушаның бөлінуімен жүргізіледі, нәтижесінде культураның өсу жылдамдығы мен популяция саны ұлғая бастайды. Әдетте бұл фазаның жалғасы жоқ.

ІІІ фаза–Жасуша санының анағұрлым активті өсу фазасы. Даму фазасы көбейюдің ең активті фазасы. Онда микроорганизмдер қарқынды дамиды, өсу шапшаңдығы да арта түседі. Бұл екі сағаттай уақытқа созылады. Кейбір жасушалар тіршілігі тежеле бастайды. 

 

 

 

 

 

                   Периодты культивирлеудегі микроорганизмнің өсу қисығы

                   Х-биомассаның саны(1 мл жасуша саны);τ-уақыт,сағ.;

                      І-лаг фаза; ІІ-өсуін жылдамдататын фаза;

                      ІІІ -экспоненциальды фаза;

                      ІҮ-өсуін баяулататын фаза;

                     Ү-стационарлы фаза;

                      ҮІ-жойылу фазасы;

 

Ол экспоненциалды немесе логарифмдік  фазаның өсуі деп аталады. Бұл  фазада жасуша белгіленген өсу жағдайына  толығымен бейімделгеннен  кейін  басталады, культураның өсуі қоректік зат түспесе де, азықтық зат  алмасуы мол болмаса да шектелмейді. Өсу жылдамдығының максимальдығы бекітіледі. Микроорганизм культурасының өсу процесін меңгеру кезінде абсолютті және меншікті өсу жылдамдығын ажырата  білу қажет.

Абсолютті өсу жылдамдығының формуласы  мынаған тең:

      

                мұнда: х – биомасса саны (г/л) (немесе жасуша саны)

                           τ – уақыт (сағ)

           

Меншікті өсу  жылдамдығы биомасса бірлігінің өсу жылдамдығымен сипатталады және мына формула бойынша есептеледі:

   

 

        мұнда:  μ-уақыт бірлігіндегі биомассаның өсуі сағ^-1.

Микроорганизмдер культурасының  меншікті өсу жылдамдығы болып  қандайда бір маңызды сипаты, организмнің  өзі және сондай-ақ культивирлеу жағдайы саналады.

 

Меншікті өсу жылдамдығы мен субстрат концентрациясының  арасында, культураның өсуі шектеледі, белгілі байланысы анықталып, Моно теңдеуі түрінде көрсетіледі: