Трансгенные животные

Эффективность получения трансгенного КРС с  использованием ретровирусной инфекции ооцитов в метафазе II второго  мейотического деления.

Преимуществом использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является то, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно  инфицированы ретровирусами.

Недостатком применения ретровирусных векторов является их ограниченная емкость (размер вставки не должен превышать 8 тысяч  п. н. Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов вырезаются интроннные последовательности, которые как  и другие дистальные или проксимальные  последовательности играют важную роль в эффективной экспрессии генов  у трансгенноых животных [Palmiter et ai, 1991]. К недостаткам использования  ретровирусных векторов следует  так же отнести подавление экспрессии трансгенов in vivo вследствие инактивации  вирусных промоторов в клетках, например, посредством а- и у-интерферонов, действующих на вирусные LTR [Ghazizadeh et ai, 1997]. Однако данная проблема может быть решена посредством включения в ретровирусную конструкцию внутренних промоторов или использованием нового поколения ретровирусов, содержащих модифицированные участки контроля экспрессии, такие как внутренний рибосомный сайт (IRES) [Salen, 1997] и тетрациклиновая регуляторная система [lida et ai, 1996].

Еще одним  ограничением использования ретровирусных  векторов для получения трансгенных  животных является их низкий титр. Обычные  ретровирусные векторы имеют  титр 1 х 105-6 колониеобразующих единиц (cfu) в мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низкий титр ретровирусов ограничивает способы  их введения в эмбрионы. Проблема низкого  титра была недавно решена посредством  разработки нового вектора на основе вируса везикулярного стоматита (псевдотип VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Известно, что  тропизм ретровируса определяется геном env, поэтому его замена в  векторе на ген env другого ретровируса  может расширить спектр хозяев и  изменить свойства ретровируса. Данная технология получила название псевдотипирования. Включение белка вируса везикулярного  стоматита С в вектор на основе Мо – MLV (Burns et al,1994) позволило сделать  его более стабильным при ультрацентрифугировании. Данный вектор может быть сконцентрирован  до титра 1x109-10 КОЕ/мл и имеет очень  широкий спектор клеток-хозяев. С  его использованием были получены трансгеные лини клеток насекомых, млекопитающих, амфибий, рыб, а также созданы  трансгенные животные. Высокий титр ретровируса сделал возможным получение  трансгенных животных посредством  инъекции содержащей вирусы среды в  перивителиновое пространство [Chan et al, 1998)/ В ооцитах крупного рогатого скота объем перивителинового пространства составляет 200-300 пкл. При использовании  вируса с титром 1*10 9-10 КОЕ/мл, инъекция 10 пкл приводит к проникновению  в перивителиальное пространство от 10 до 100 инфекционных вирусных частиц. Если титр вируса равен 1*105-6 КОЕ/мл, то для введения в эмбрион одной вирусной частицы понадобилось не менее 1 нл раствора .

К недостаткам  использования ретровирусов относится  возможность клеточных онкогенов  посредством вирусных транскрипционных последовательностей. Даже при применении ретровирусов, которые не могут существовать как инфекционные вирусные частицы, существует хотя и очень небольшой, но риск, что при рекомбинации с  присутствующими в эмбрионах  эндогенными ретровирусными последовательностями могут образовываться новые активные формы ретровирусов.

Не смотря на перечисленные недостатки и ограничения, ретровирусы могут быть широко использованы для трансгенеза в животноводстве. Успешное введение генетического материала  в ооциты делает возможным проведение генной терапии наследственных заболеваний. Использование ретровирусных векторов позволяет осуществлять трансформацию  отдельных органов. Так, Archer с соавторами [1994] ввели в молочную железу козы путем инфузии через сосковый канал в период гормонально индуцируемого  маммогенеза ретровирус, кодирующий гормон роста человека (hGH). Лактация наступила на 14-ый день гормональной обработки. Максимальный уровень hGH (60 нг/мл) наблюдался в первый день лактации и затем опускался до 12 нг/мл на 9-12 дни лактации.

Аналогичные эксперименты с использованием экспрессионного  вектора pLNS, полученного на основе Mo-MLV проводятся в отделе биотехнологии  Всероссийского НИИ животноводства.

LTR –  длинный концевой повтор , ψ+ - сигнал  упаковки, Н4 – промотер гистона  человека, NEO – ген устойчивости  к неомицину,ЕР – делеция в  области промотера-энхансера, рА  – сигнал полиаденилирования  Данный вектор содержит только  цис-действующие последовательности  генома вируса, необходимые для  репликации. Последовательности вируса, кодирующие белки, исключены из  векторной конструкции. Вектор  содержит 5' длинный концевой повтор LTR, с которого происходит транскрпция,  ψ+ область, ответственную за  упаковку вирусного генома в  вирион, ген устойчивости к неомицину, под контролем промотера Н4 гистона человека для селективного введения конструкции в клеточную линию и 3' LTR с делецией в области промотера-энхансера вируса. После одного цикла репликации делеция в области ЕР LTR будет присутствовать на обоих концах провируса, регуляторные элементы провируса будут полностью инактивированы и клонированные гены будут экспрессироваться только под контролем собственных промотеров.

Доказана  возможность успешной инфекции альвеолярных клеток молочной железы свиней и коров  рекомбинантными ретровирусами..

Инфекция  молочной железы не носит локального характера. Последовательности провируса  помимо опытных долей вымени были выявлены в контрольных долях  молочной железы, в слюнной железе, селезенке, поджелудочной железе, спинном  мозге, надпочечниках. ИФА молока свиней выявил наличие рекобинантного продукта в количестве от 30 до 290 нг/мл.

Основными недостатками метода непосредственной инфекции отдельных органов животных является необходимость использования  большой дозы ретровирусов с тем, чтобы инфицировать достаточное  число клеток, а так же невозможность  передачи трансгена по наследству следующему поколению животных. Однако в отличие  от введения грансгенов в эмбриональные  линии, данный подход позволит синтезировать  рекомбинантные продукты в молоко уже  через несколько месяцев после  начала эксперимента. Для КРС по сравнению с традиционным методом  микроинъекции затраты времени  от начала эксперимента и до получения  первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются, соответственно, с 4-5 лет до 4 5 месяцев.

1.3 Метод пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro

Еще одним  способом получения трансгенных  млекопитающих является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы как стволовые клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Впервые экспрессия генных конструкций в соматических тканях химерных мышей, полученных с использованием трансформированных клеток эмбриональной карциномы, была доказана Stewart с соавторами [1985]. Доля химерных мышей была очень высокой, причем часть из них передавала трансген по наследству. Однако в настоящее время наибольшее распространение для получения химерных животных получили эмбриональные стволовые клетки, ЭСК [Robertson et al., 1986]. Преимуществом получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Это означает, что каждый эмбрион, развившийся в культуре после пересадки ядер, будет трансгенным и последующая селекция трансгенных эмбрионов не требуется. Кроме того, пересадка таких эмбрионов реципиентам приведет к рождению только трансгенного потомства. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК делает возможным в ряде случаев проводить оценку экспрессии трансгенов, что имеет немаловажное значение. При микроинъекции трансгены наугад интегрируются в любую часть генома. Это означает, что они могут разрушать весьма существенные гены (инсерционные мутации) или размещаться в тех частях хромосомы, которые недоступны для транскрипции. Тестирование экспрессии в культуре сделает возможным использование для пересадки ядер, а следовательно и для получения трансгенных животных только тех клеточных линий, в которых трансгены являются транскрипционно и трансляционно активными. Кроме того, в отличие от метода пронуклеарной инъекции исследование ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного хххххххххх

Сенсационное  сообщение было опубликовано в 1996 году в Nature. Была продемонстрирована возможность  получения жизнеспособных овец посредством пересадки ядер соматических клеток, культивируемых in vitro. Позже сообщили о получениитрансгенных овец посредством пересадки ядер стабильно трансформированных первичных фетальных фибробластов (Schnieke et al., 1997). Из шести полученных трансгенных ягнят пять оказалось жизнеспособными. Степень трансгенности при использовании данной, метода составляла 100%, в то время как применение метода микроинъекции в той же лаборатории позволяло получить лишь 4,35% трансгенных потомков от числа родившихся животных. Для получения одного трансгенного ягненка методом пересадки ядер требовалось 20,8 овец, в то время как при использовании метода пронуклеарной инъекции - 51,4 овцы [Schnieke et at., 1997]. Как и при использовании ЭСК, данный метод позволяет проводить анализ интеграции в культуре клеток, а также осуществлять целенаправленное встраивание генных конструкций в желаемые участки генома. Кроме того, используемые клеточные линии могут быть кариотипизированы в культуре, что позволит заранее предопределять пол трансгенных животных. После получения трансгенных животных из различных клеточных линий и определения уровня экспрессии может быть произведен отбор желательных клонов для их дальнейшего использования в пересадках ядер.

Схема получения  трансгенных животных с использованием стабильно трансформированных клеток.

1.4 Липосомы как переносчики  ДНК

Векторами для переноса генных конструкций  в эмбриональные линии млекопитающих  могут служить липосомы [Rottmann et al, 1985], однако опосредованный ими перенос  генов не получили широкого распространения

1.5 Использование половых клеток  семенников (спермии и сперматогонии)

Сперматозоиды являются природным вектором, доставляющим ДНК в клетку. Использование спермиев в качестве переносчиков одной ДНК  рассматривается как один из перспективных  методов генетической модификации  животных. В опытах Lavitrano (1989) 30% мышей  полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству.

Многочисленные  попытки в других лабораториях неуспешными. Анализ 1300 мышей, родившихся in vitro обработанной ДНК спермой, не выявил трансген ни у одной из исследованных особей [Brinster, 1989), Недавнее исследования показали, что при применении метода переноса ДНК посредством сперматазоидов в одной и той же лаборатории  дае пра использовании одинаковой схемы исследований могут быть получены противоречивые результаты [Maiore et al, 1998]. Это позволяет предположить, что  встраивание ДНК происходит только на определенной стадии клеточного цикла. Однако до настоящего времени не установлен механизм интеграции экзогенной ДНК  в геном сперматозоидов.

Huguet и  Esponda [1998] исследовали способность  сперматозоидов поглощать линейную  ДНК in vitro и in vivo. В опытах in vitro отмытые придатковые сперматозоиды  инкубировали 2 часа с линейной  ДНК. ДНК инъецировали в проксимальную  область семенных канальцев, после  чего через 6 часов извлекали  сперматозоиды. Присутствие чужеродной  ДНК было показано у 60-70% сперматозоидов. Сперматозоиды способны поглощать  ДНК, аккумулировать ее в ядре. Секркты придатков и семенных  канальцев не блокируют этот  процесс.

Для повышения  эффективности связывания ДНК со сперматозоидами используют различные  методы: ДНК-липосомные комплексы [Bachiller et al.. 1991], инъекцию в семенники [Sato et al.. 1994], непосредственную инъекцию в  семенные канальцы [Kim et al.. 1997] и придатки [Huguet и Esponda, 1998], инъекцию в семенные канальцы с последующей электропорацией [Yamazaki et al.. 1998], ко-инъекцию головок спермиев и ДНК в ооциты [Perry et al. 1999]. Также было показано, что экзогенная ДНК может быть эффективно доставлена в ооциты микроинъецированными сперматозоидами.

Большое внимание в последнее время привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников-сперматогониями [Brinster, Nagano. 1998]. Была продемонстрирована возможность  переноса сперматогониев от одного самца  другому как у животных одного вида (Avarbock, 1994; Brinster и Zimmermann. 1994), так  и между двумя видами.

После пересадки  половых клеток из семенников самца  мыши в семенники другого самца, до 80% потомства происходило из сперматозоидов самца-донора. Была доказана возможность  успешного протекания сперматогенеза после пересадки криоконсервированных клеток семенника и после их длительного  консервирования.пересадке в семенники  мышей клеток из семенников поздних  стадий сперматогенеза половых клеток доноров выявлено не было /Dobnnski et al., 1999].

Успешное  длительное культивирование половых  клеток животных in uru делает возможным  проведение трансформации сперматогониев экзогенной ДНК с последующей  селекцией. Nagano с соавторами /2000] сообщили об успешном введении экзогенной ДНК  в сперматогонии т vitro и in vivo посредством  ретровирусной системы доставки. Экспрессия ретровирусной генной конструкции, включающей lacZ, наблюдалась в семенниках более 6 месяцев. Анализ показал, что  по крайней мере 1 из 300 стволовых  клеток семенников содержали трансген.

В сочетании  с пересадкой трансформированных половых  клеток в семенники реципиентов  и успешным протеканием сперматогенеза подход может быть использован для  получения трансгенного потомства.

Не смотря на хорошие результаты в использовании  сперматозоидов для получения трансгенных  мышей, а так же отдельные успешные попытки получения трансгенных  свиней и КРС [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], каких-либо значительных успехов в получении трансгенных сельскохозяйственных животных с помощью трансформированных сперматогониев и спермиев до настоящего времени достигнуто не было. Достижения в использовании трансгенных технологий.