Биологическая активность почвы и методы ее определения

Общие показатели численности  микробов, как бы условны они не были, представляют определенный интерес. На их основании можно примерно вычислить  массу совокупности микроорганизмов  в почве. Как показывают подсчеты, она составляет десятые доли процента массы почвы. По мере перехода от северных почв к южным процент микробной массы в них увеличивается. В общем, от 0,1 до 1,0% почвенного органического вещества состоит из клеток разных микроорганизмов, вызывающих глубокие изменения органических и минеральных составных частей почвы[1].

При анализе почв нередко  учитывается количество отдельных  физиологических групп микроорганизмов. Это делается так называемым методом  титра, при котором жидкие избирательные (элективные) питательные среды для определенных групп микроорганизмов заражают разными разведениями почвенной суспензии. Устанавливая после выдержки в термостате степень разведения, показавшего наличие искомой группы микроорганизмов, можно затем простым перерасчетом определить численность ее представителей в почве. Таким путем узнают, насколько почва богата нитрификаторами, денитрификаторами, целлюлозоразлагающими и другими микроорганизмами.

Для характеристики типа почвы  и ее состояния важны не только показатели численности разных групп микроорганизмов, но и анализ состояния в почве отдельных их видов. За редкими исключениями, даже физиологические группы микроорганизмов очень широки. Внешняя обстановка может резко менять видовой состав почвенных микроорганизмов, но мало или совсем не отражается на количестве их физиологических групп. Поэтому при анализе почвы важно стремиться установить состояние отдельных видов микроорганизмов.

Среди почвенных микроорганизмов  встречаются представители разных систематических единиц, способные  ассимилировать не только легкоусвояемые органические соединения, но и более сложные вещества ароматической природы, к которым относят такие характерные для почвы соединения, как перегнойные вещества.

Глава II. Методы определения биологической активности почвы.

Биологическую активность почв определяют, пользуясь  самыми различными микробиологическими (прямой подсчет микроорганизмов  разных групп), биохимическими (определение  ферментативной активности почв), физиологическими (физиологический метод определения  биомассы организмов, определения дыхания почв) и химическими (определение нитратов, нитритов, аммония) методами.

2.1. Методы оценки  суммарной активности отдельных  микробиологических процессов в  почве.

К  показателям  суммарного эффекта деятельности почвенных микроорганизмов, определение которых нетрудоемко и не требует специальной подготовки и специализированной лаборатории, можно отнести: нитрификационную способность, интенсивность разложения льняной ткани («аппликационный метод»), протеазную активность, а также токсичность почвы. Нитрификационная способность почвы характеризует потенциальную возможность почвы по накоплению минерального азота.

Нитрификационную способность  определяют по возрастанию в почве  содержания нитратов, при некотором  выдерживании ее в оптимальных для микроорганизмов условиях. В опытах, не связанных со специальным изучением изучением азотного режима почвы, определение нитрификационной способности проводят в почве без добавления каких-либо веществ. Для этого 100 г почвы помещают в коническую колбу на 250 мл, увлажняют кипяченой водой, количество которой должно довести влажность почвы до 60% полной влагоемкости (чаще 10-15 мл). Колбу закрывают ватной пробкой, взвешивают и помещают на 30 дней в термостат с температурой 27-28^оС. Контролем служит стерильная почва, предварительно выдержанная в сушильном шкафу при 160-180^оС 3 ч, в которую для получения требуемой влажности добавляют дополнительное количество воды. Влажность в колбах в течение опыта должна быть постоянной (необходимость доувлажнения устанавливают при периодическом взвешивании колб). В конце опыта в агрохимической лаборатории определяют содержимое нитратов в почве: данные контроля (стерильная почва) вычитают из результатов варианта опыта. Повторность каждого варианта – трех- четырехкратная[5]. 

В опытах, имеющих задачу подробного исследования азотного режима почвы, помимо определения нитрификационной способности почвы в естественном состоянии, проводят еще одно определение  с внесением дополнительных веществ  – сульфата аммония, органики, мела. При этом выявляют потребность почвы в удобрении, ее буферность, необходимость известкования, интенсивность нитрификации органических азотистых соединений.

Целлюлозную активность почвы  методом «аппликации» определяют по разложению в ней льняной ткани. Но поскольку степень активности целлюлозных микроорганизмов зависит от наличия в почве также доступного азота, фосфора и других элементов, то степень распада, можно считать, отражает «напряженность хода микробиологических процессов вообще»[5].

Применяемые в практике опытного дела способы закладки ткани в почву несколько различаются. Можно рекомендовать следующую модификацию этого метода. Белую льняную ткань размером 20х5 см взвешивают и нитками в нескольких местах прикрепляют к полоске полиэтиленовые пленки того же размера. Длина полос может быть различна в зависимости от особенностей опыта и почвы. На делянках делают равномерные прикопки, к ровной вертикальной стороне каждой из них прижимают ткань и засыпают с другой стороны, уплотняя ее до исходного состояния. Место закопки полотна отмечают этикеткой, колышком. На каждом варианте делают 5-6 таких прикопок. На варианте с ожидаемой большей активностью целлюлозных микроорганизмов закапывают дополнительно 2-3 полотна для периодического контроля.

Экспозицию определяют интенсивностью разложения полотна, которая зависит от плодородия почвы, погодных условий, удобрений, характера растительности и других условий. Полотна вынимают из почвы, когда становится очевидным, что продолжение экспозиции приведет к потерям ткани при выкопке. После отмывания и просушивания их взвешивают. По разности массы до и после экспозиции определяют убыль сухой массы ткани и выражают ее в процентах.  Полотно можно разделить на части и получить числовые данные для разных слоев и горизонтов. Интенсивность микробиологической активности  в почве «аппликационным» методом можно установить быстрее, если на неразложившейся ткани специальными реактивами «проявить» продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Так, уже на седьмой-десятый день пребывания в почве на ней обнаруживаются среды аминокислот, которые синтезируются микроорганизмами при разложении клетчатки. Экспозиция полотна в почве при выявлении аминокислот сокращается до 15-30 дней. В этом случае его не моют, а после высушивания осторожно очищают ершиком от почвы. Затем полоски ткани помещают на 10 мин в раствор 0,5%-ного раствора нингидрида в ацетоне и высушивают при комнатной температуре в течение 24 ч. За это время на полотне проявляются аминокислоты в виде фиолетовых пятен.

Метод «аппликаций» очень нагляден для демонстрации интенсивности микробиологической деятельности в разных слоях пахотного горизонта при проведении различных обработок, внесении удобрений, сравнении приемов орошения[5].

Протеазную  активность почвы определяют при  помощи фотобумаги. Ферменты протеазы в почве обусловливают динамику азота, который в доступной форме выделяется при последовательном расщеплении белковых веществ. Протеазы участвуют в активации этого процесса. Метод основан на микробиологическом расщеплении желатины, имеющейся в эмульсионном слое фотобумаги, которую закапывают в почве. Фотобумагу прикладывают эмульсионной стороной к ровной, свежезачищенной стенке почвенного разреза (или прикопки) и засыпают землей, уплотняя ее до естественного состояния. Продолжительность экспозиции (обычно до четверо суток) определяют в каждом конкретном опыте по специальным контрольным прикопкам, из которых бумагу вынимают каждый день, проявляя при этом осторожность, т.к. набухает ее эмульсионный слой. Извлеченную из почвы фотобумагу отмывают от почвы под слабой струей воды и высушивают в тени на воздухе. Чем сильнее разжижение желатинового слоя, тем выше протеазная активность почвы: такие зоны приобретают темную окраску. Лучше использовать фотобумагу типа «бром-портрет» (без защитного слоя), которую обрабатывают3%-ной соляной кислотой (15 мин), промывают и высушивают[5].

Токсичность почвы проявляется при некоторых условиях в угнетении высших и низших растений. В значительной степени она обусловлена накоплением токсинов и антибиотиков, являющихся продуктами жизнедеятельности различных типов микроорганизмов; определяют ее при помощи растительного теста. Навеску каждого образца почвы (60 г) помещают в чашку Петри, увлажняют до пастообразного состояния и металлическим шпателем выравнивают поверхность, затем на ней равномерно раскладывают, а потом вдавливают 25 семян тест-растения, которые предварительно замачивают в водопроводной  воде; в контрольном варианте их раскладывают на фильтровальную бумагу, под которой находится смоченная водой вата. Проращивание семян продолжается 5-7 дней при ежедневном увлажнении почвы равными порциями воды. После окончания опыта с контрольным вариантом сравнивают число проросших семян, длину проростков и корней растений. Токсичными следует считать почвы, снижающие всхожесть семян или угнетающие рост проростков и корней не менее чем на 20-30%. Повторность при этом должна быть трехкратной. Для опыта можно использовать семена различных растений – пшеницы, гороха, но с учетом того, что мелкие семена имеют меньший запас питательных веществ и более подвержены влиянию внешней среды. Обязательное условие - возможно минимальный срок между взятием почвенного образца и посевом семян, т.к. токсичны – нестойкие вещества[2].

2.2. Методы определения  дыхания почвы.

Почвенный воздух имеет большое значение для почвенных  процессов и роста растений. Он участвует в химических и биохимических процессах, протекающих в почве, оказывает влияние на окислительно– восстановительные условия в почве, ее реакцию и растворимость химических компонентов. Почвенный воздух важен для углеродного питания растений (более половины углекислого газа, идущего на формирование урожая сельскохозяйственных культур, потребляется растениями из почвы). Его состава изменяется во времени и по профилю почвы, зависит от внесения органических и минеральных удобрений, вида растений, биологической деятельности почвы, гидротермических условий и т.д.

Решающая роль в продуцировании принадлежит биологическим  факторам. Газовый режим почвы  складывается из следующих показателей: содержание воздуха в почве, его  состава, аэрации и интенсивности  выделения газов. Определения проводят каждые 15 дней или приурочивают к фазам развития растений. Одновременно ведут наблюдения за давлением и температурой воздуха и почвы.

Все методы определения  дыхания почвы можно разделить  на 3 группы:

1. Методы обогащения CO₂ в изолирующем устройстве (колоколе): определяются начальная и конечная концентрация углекислого газа в воздухе изолятора, установленного на поверхности почвы.
2. Методы проветривания: ток воздуха протягивается через изолятор (колокол, цилиндр), поставленный на поверхность почвы и углекислый газ непрерывно поглощается.

3.  Методы  адсорбции: под изолятор над  почвой помещается сосуд со  щелочью, которая непрерывно адсорбируется  углекислым газом.

Упрощенные  методы определения интенсивности  дыхания почвы основаны на учете  количественных изменений углекислого газа в окружающем воздухе с помощью широкогорлых конических колб. Метод «колб» имеет недостаток, т.к. дыхание почвы происходит в замкнутом пространстве, внутри колбы уменьшается парциальное давление кислорода и нарушается газообмен. А.Ш. Галстян предложил для устранения этого недостатка соединить колбу, где происходит дыхание почвы, с наружным воздухом с помощью трубки с натроновой известью.

Ход анализа. 10 г свежей почвы в марлевом мешочке  подвешивают за крючок в пробке (при  анализе влажной почвы используют металлические корзинки). В плоскодонную колбу на 250 см³ наливают 25 мл 0,025 М раствора гидрата окси бария. Колбу закрывают пробкой с мешочком и помещают в термостат с температурой 280-300^оС на 24 часа. Одновременно с опытными колбами ставят контрольные с гидратом окиси бария, но без почвы для учета углекислого газа воздуха в колбе. Колбы периодически встряхивают для разрушения образовавшейся пленки карбоната бария. После экспозиции избыток гидрата окиси бария оттитровывают  0,05 М раствором HCl по фенолфталеину. По разнице между данными титрования контрольной и опытной почвы определяют количество выделившегося углекислого газа. Интенсивность продуцирования выражают в миллиграммах углекислого газа, выделившегося за сутки на 100 г почвы. Адсорбционный метод определения углекислого газа, выделившегося из почвы, позволяет вести наблюдения непосредственно в поле сразу на нескольких вариантах опыта. Эти методы были предложены Штатновым, Миной и Карпачевским. Недостаток применяющихся вариантов метода Штатнова и Мины в том, что они не учитывают двух факторов, влияющих на результат определения. При отсутствии перемешивания жидкости в поглотителе сорбция CO₂ щелочью быстро затухает.

Поглощение  СО₂ зависит от площади поглотителя, т.к. расчет в адсорбционном методе Штатнова ведется на изолированную площадь, но чем меньше площадь поглотителя, тем меньше получается интенсивность выделения углекислого газа. В.Н. Мина рекомендовал брать поглотитель с площадью близкой изолированной поверхности почвы. Однако расчет выделения СО₂ из почвы показал, что поглощение зависит не от площади изоляции, а только от площади поглотителя. Л.О. Карпачевский предложил использовать только площадь поглотителя и определение проводить непосредственно в поле[5].

Определение содержания выделившегося углекислого газа по Л.О. Карпачевскому. В стеклянные стаканчики на 50 мл диаметром 4-6 мс. Приливают пипеткой 2 мл 0,1 М раствора КОН. Стаканчики ставят на поверхность почвы опытного участка, секундомером отмечают время начала опыта. Через 20 мин раствор в стаканчиках оттитровывают из микробюретки 0,05 М Н₂SO₄ по фенолфталеину. Расчет ведут в кг/га[5].