Бактериофаги. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой

Эту перестройку и последующее новообразование фаговой ДНК можно проследить по увеличению количества 5-гидроксиметилцитозина - основания, специфичного для ДНК Т-четных фагов.

Необходимые для синтеза фаговой ДНК ферменты образуются в клетке уже вскоре после заражения; это так называемые «ранние» белки. К «поздним» белкам относятся белки оболочки и фаговые лизоцимы, или эндолизины; они образуются лишь во второй половине латентного периода.

Репликация фаговой ДНК протекает в соответствии с общим механизмом репликации, однако детали этого механизма варьируют в зависимости от того, реплицируется ли фаговая ДНК в виде кольцевой (симметричный и асимметричный способы) или в виде линейной молекулы.

В течение очень короткого периода (минуты) в клетке синтезируется несколько сотен новых фаговых хромосом, которые по мере образования беспорядочно обмениваются генетическим материалом [5, с. 423].

РНК-содержащие бактериофаги.

У многих бактериофагов генетическим материалом в вирионах является одноцепочечная молекула РНК.

Сразу же после того, как молекула вирусной РНК проникает в цитоплазму клетки-хозяина, она опознается рибосомами как информационная. Рибосомы связываются с ней и синтезируют на этой РНК вирусные белки, в том числе РНК-репликазу (РНК-зависимую РНК-полимеразу). Этот фермент осуществляет репликацию вирусной РНК, полимеризуя рибонуклеозидтрифосфаты и используя в качестве матрицы вирусную РНК. Новосинтезированные «плюс» - цепи либо вновь используются репликазой для образования новой формы, либо соединяются с капсомерами, образуя зрелые вирионы.

Таким образом, после проникновения в цитоплазму клетки вирусная РНК немедленно узнается как информационная РНК, присоединяется к рибосомам и транслируется с образованием вирусных белков. Один из этих белков - сложный фермент РНК-полимераза, которая обеспечивает полимеризацию рибонуклеозидтрифосфатов аденина, гуанина, цитозина на матрице вирусной РНК.

Полная нуклеотидная последовательность определена в РНК фага MS2. Эта РНК представляет собой одну молекулу, состоящую из 3566 нуклеотидов, содержит 3 функциональных гена, кодирующих соответственно РНК-полимеразу, белок оболочки и минорный белок (белок А). Одноцепочечная РНК способна складываться с образованием двухцепочечных участков путем спаривания оснований; это вторичная структура играет большую роль в регуляции репликации вирусной РНК и ее трансляции.

Белковые субъединицы головки и хвостовой части фага самопроизвольно агрегируются (самосборка) с образованием полного капсида. Эта самосборка идет в определенной последовательности.

IV cтадия - морфогенез фага. Созревание состоит в необратимом объединении нуклеиновой кислоты и белковой оболочки фага. Зрелая частица представляет собой морфологически типичный инфекционный вирус, который не репродуцируется в той клетке, в которой он образовался. Если клетки лизировать клетки в поздней стадии латентного периода, то можно обнаружить незрелые фаговые частицы, в которых ДНК еще не соединена с белком необратимо и может быть легко выделена [3, с. 341].

V стадия - высвобождение зрелых  вирионов. При литической инфекции в конце латентного периода в клетке появляется еще один «поздний» вирусспецифический белок - фаговый лизоцим. Этот фермент воздействует на пептидогликановый слой стенки бактериальной клетки, гидролизуя связи между остатками сахара в цепях остова слоя. В результате стенка становится все менее прочной, размягчается и, в конце концов, разрывается под действием внутриклеточного осмотического давления, а фаговое потомство выходит вместе с остальным содержимым клетки в окружающую среду. Весь литический цикл от адсорбции бактериофага на бактерии до его выхода из нее занимает 20-40 мин.

Хотя обычно фаги высвобождаются из клетки-хозяина в результате ее лизиса, из этого общего правила имеется исключение, которое составляют нитевидные ДНК-содержащие фаги, например, уже упоминавшийся фаг fd. В этом случае новосинтезированные белки фаговой оболочки располагаются на клеточной мембране. Созревание фага и его высвобождение происходит в результате того, что фаговая ДНК выталкивается из клетки и во время прохождения через мембрану соединяется с белком оболочки. Во время этого процесса высвобождения фаговых частиц (почкование) клетка-хозяин остается жизнеспособной и продолжает расти и развиваться.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Лизогения

 

Умеренные бактериофаги заражают бактерий-хозяев, но не размножаются в них автономно и не вызывают лизиса - интегративный тип взаимодействия. При интегративном типе - геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней.

Культуры, содержащие латентный фаг, называются лизогенными. Лизогения передаётся потомству бактерии. Лизогенная культура может содержать 2—3 и более фагов; она, как правило, устойчива против находящихся в ней фагов (лишь небольшая часть клеток лизируется и освобождает зрелые фаги). Воздействуя на лизогенную культуру ультрафиолетовыми или рентгеновскими лучами, перекисью водорода и некоторыми другими веществами, можно значительно увеличить количество клеток, освобождающих фаг (т. н. индукция бактериофагов).

Лизогения широко распространена среди всех видов бактерий и актиномицетов. В ряде случаев многие свойства лизогенной культуры (токсичность, подвижность бактерий и др.) зависят от наличия в ней определённых профагов.

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. [6, с. 322]

Это название (от греч. lysis — разложение, genea — происхождение) отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда физических и химических факторов исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму, т.е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага получило название фаговой конверсии. Последняя имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней переносит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет лизогенной, она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов.

Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству. Так, если микроорганизмы, используемые в качестве продуцентов вакцин, антибиотиков и других биологических веществ, оказываются лизогенными, существует опасность перехода умеренного фага в вирулентную форму, что неминуемо приведет к лизису производственного штамма. [2, с. 236]

Редуктивная инфекция.

Ее вызывают только умеренные фаги. В этом случае их жизненный цикл складывается из следующих стадий:

а) адсорбция фага на поверхности клетки;

б) проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку;

в) сайт - специфическая интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и превращение фага в профаг.

Если первые две стадии протекают так же, как в случае продуктивной инфекции, то третья требует участия дополнительных фаговых и хозяйских генов.

Механизм интеграции фаговой ДНК в хромосому бактериальной клетки лучше всего изучен на примере фага λ (лямбда). Фаг состоит из головки и хвостика. Его геном представлен двунитевой линейной ДНК, имеющей «липкие» концы (избыточные нуклеотидные последовательности на противоположных концах нитей, комплементарные друг другу), поэтому она может переходить в кольцевую структуру, необходимую для ее включения в хромосому клетки-хозяина. ДНК фага X имеет м. м. около 30 МД, содержит 46 500 нуклеотидных пар и несет 32 гена, 7 из которых кодируют головку, 11 - хвостик, а остальные играют регуляторную роль.

Фаг λ включается в хромосому Е. colt между генами gal и bio с помощью сайт - специфической рекомбинации. Она оказывается возможной потому, что ДНК фага имеет особый участок - attP (от англ. attachment phage - прикрепление фага). Такой же участок имеется и в хромосоме Е. coli - attB. Он расположен между генами gal и bio. Участки att имеют сложную структуру и состоят из 250 нуклеотидов. В результате рекомбинации между attP и attB, протекающей по механизму кроссннговера, фаговая ДНК оказывается включенной в хромосому, причем слева она фланкирована участком attL (от англ. left - левый), а справа - attR (от англ. right - правый), которые образуются вследствие рекомбинации между attP и attB. Рекомбинация протекает с участием генов red фага и гесА - бактерии. Для интеграции требуется также белок фага - продукт гена int (интеграза) и особый хозяйский белок интеграции.

Таким образом, геном фага, интегрируясь в хромосому, превращается в профаг, а клетка становится лизогенной. Выходу профага из хромосомы препятствует цитоплазматический репрессор, который наделяет клетку одновременно иммунитетом против повторного инфицирования данным фагом. Синтез репрессора контролируется фагом. Однако профаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из хромосомы клетки и вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом клетки и выходом из нее вновь синтезированных вирионов. Механизм выхода (исключение фага) из хромосомы состоит в том, что происходит рекомбинация между attL и attR, в результате которой восстанавливаются attP и attB, а фаговая ДНК принимает кольцевидную структуру и исключается из хромосомы. Процесс выхода требует участия, помимо указанных выше белков, еще одного белка - продукта фагового гена xis (ген эксцизии, исключения).

Умеренные фаги играют важную роль в обмене генетическим материалом между бактериями. Этот процесс получил название трансдукции. Различают общую (генерализованную, или неспецифическую) и специфическую трансдукцию.

Общая трансдукция.

Механизм ее заключается в том, что в процессе внутриклеточного размножения фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равный по длине фаговой. Это вполне возможно, так как в инфицированной клетке биосинтез ее ДНК блокирован, а сама ДНК подвергается распаду. Таким образом в процессе репродукции фага возникают дефектные вирионы, у которых в головках вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, содержащуюся в головке, но при этом размножения фага не происходит. Введенная в клетку реципиента донорная ДНК (фрагмент хромосомы донора), если она содержит гены, отсутствующие у реципиента, наделяет его новым признаком. Этот признак будет зависеть от того, какой ген (гены) попал в головку трансдуцирующего фага. В случае рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки - реципиента этот признак наследственно закрепляется.

Специфическая трансдукция. [6, с. 312]

Отличается от неспецифической тем, что в этом случае трансдуцирующие фаги всегда переносят только определенные гены, а именно, те из них, которые располагаются в хромосоме лизогенной клетки слева от attL или справа от attR. Специфическая трансдукция всегда связана с интеграцией умеренного фага в хромосому клетки-хозяина. При выходе (исключении) из хромосомы профаг может захватить ген с левого или правого фланга, например или gal, или bio. Но в этом случае он должен лишиться такого же размера своей ДНК с противоположного конца, чтобы ее общая длина оставалась неизменной (иначе она не может быть упакована в головку фага). Поэтому при такой форме исключения образуются дефектные фаги: A - dgal или Xdbio.

Специфическую трансдукцию у Е. coli осуществляет не только фаг лямбда, но и родственные ему лямбдоидные и другие фаги. В зависимости от места расположения сайтов attB на хромосоме они при своем исключении могут включать различные бактериальные гены, сцепленные с профагом, и трансдуцировать их в другие клетки. Встраивающийся в геном материал может замещать до 1/3 генетического материала фага.

Трансдуцирующий фаг в случае инфицирования реципиентной клетки интегрируется в ее хромосому и привносит в нее новый ген (новый признак), опосредуя не только лизогенизацию, но и лизогенную конверсию.