Получение ферментного препарата амилазы методом поверхностного культивирования

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

 «Казанский национальный  исследовательский технологический  университет» (ФГБОУ ВПО «КНИТУ»)

 

 

Кафедра пищевой биотехнологии

 

 

Курсовой проект

На тему: «Получение ферментного препарата амилазы методом поверхностного культивирования»

 

 

 

Выполнила студентка

ФПИ ИППиБТ гр. 629311

Баторшина Ольга Сергеевна

 

 

 

 

Казань, 2014

Содержание

 

Введение

1.Теоретический аспект  изучения амилаз

1.1 Физико-химические свойства α-Амилаза

1.2 Механизм действия.

1.2 Обзор возможных способов  получения

2. Особенности получения  амилаз

2.1 Обоснование целесообразности  использования биотехнологических  приемов в производстве амилаз

2.2 Химический состав и  физико -химические свойства сырья и полуфабрикатов

2.3 Особенности применения  продукта в производстве продуктов  питания

3. Описание технологической  схемы поверхностного культивирования

Заключение

Список используемых источников

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Актуальность данной работы в том, что ферментные препараты представляют собой концентраты ферментов, полученные с помощью микроорганизмов, содержащие в своем составе наряду с ферментами балластные вещества. Ферментные препараты применяют в пищевых производствах как катализаторы соответствующих биохимических процессов.

В качестве продуцентов ферментов используют разнообразные источники: растения, животные ткани и микроорганизмы. Основные промышленные микроорганизмы для производства ферментных препаратов — это микроскопические грибы рода Aspergillus, Rhizopus.Penicillium и другие, а также бактерии рода Bacillus и актиномицеты. Они являются активными синтезаторами амилолитических, протеолитических, пектолитических и других ферментов.

Способностью активно продуцировать целлюлолитические ферменты обладают представители ряда несовершенных грибов родов Alternaria, Trichoderma, Fusarium и др. Важным требованием к применяемому продуценту является его способность к образованию большого количества какого-либо одного фермента при незначительном количестве других ферментов.

Объектом данной работы является ферментный препарат амилазы. Выбор настоящего объекта связан с тем, что в настоящее время применение ферментных препаратов является неотъемлемой часть большинства технологических процессов промышленности и сельского хозяйства. В частности, протеолитические и амилолитические ферменты используются в пивоварении, хлебопечении, мясо-молочной и спиртовой промышленности, находят широкое применение в текстильной промышленности, в производстве детергентов, в качестве кормовых добавок в сельском хозяйстве, для переработки отходов мясной и птицеперерабатывающей промышленности.

Микробные амилазы применяют в медицине, тонкой химической технологии, текстильной, бумажной и пищевой промышленности, в частности, в пивоварении, хлебопечении, крахмалопаточном, кондитерском и спиртовом производстве. В промышленном биокатализе наибольшую ценность представляют термостабильные амилазы, синтезируемые, как правило, термофильными микроорганизмами. Их использование позволяет внедрять в производство эффективные ресурсосберегающие технологии.

Предметом данной работы является  получение ферментного препарата амилазы методом поверхностного культивирования.

Целью данной работы является характеристика получения ферментного препарата амилазы методом поверхностного культивирования.

В связи с данной целью, поставлены задачи:

-рассмотреть особенности  амилотических ферментов;

-охарактеризовать физико-химические  свойства;

-рассмотреть возможные  способы получения;

-дать характеристику  получения ферментного препарата  амилазы методом поверхностного  культивирования.

Структура работы соответствует логике поставленных целей и задач и состоит из введения, основной части, заключения, списка использованной литературы.

 

 

 

 

 

 

1.Теоретический аспект  изучения амилаз

1.1 Физико-химические  свойства а-Амилазы

Амилазы очень широко распространены в природе. Они синтезируются многими микроорганизмами (бактерии, грибы, актиномицеты, дрожжи), животными и растениями. До развития ферментной промышленности главным промышленным источником получения амилаз в европейских странах было проросшее зерно  (солод). Для медицинских целей амилазы получали из животного  сырья. В настоящее время главным источником амилаз являются микро организмы, особенно  бактерии, грибы и реже дрожжи.

Таблица 1-Классификация ферменто в

Класс	Катализируемая реакция	Тип реакции	Важнейшие по дклассы
КФ 1 О ксидо редуктазы	О кислительно -во сстано вительные реакции. Перено с ато мо в H и O или электро но во т о дно го  субстрата на друго й	AH + B → A + BH (во сстано вленный) A + O → AO (о кисленный)	дегидро геназа, о ксидаза, перо ксидаза,редуктаза, мо но о ксидаза, дио ксигеназа
КФ 2 Трансферазы	Перено с функцио нально й группы о т о дно го  субстрата на друго й. Это  мо жет быть метильная, ацильная, фо сфатная группа или амино группа.	AB + C → A + BC	амино трансфераза, фо сфо трансфераза, C1-трансфераза, глико зилтрансфераза
КФ 3 Гидро лазы	О бразо вание двух про дукто в из о дно го  субстрата в результате гидро лиза.	AB + H2O → AOH + BH	эстераза, глико зил-гидро лаза, пептидаза,амидаза
КФ 4 Лиазы (синтазы)	Негидро литическо е до бавление или удаление группы к или о т субстрата. О бразо вание C-C, C-N, C-O или C-S связи.	RCOCOOH → RCOH + CO2	C-O-лиаза, C-S-лиаза, C-N-лиаза, C-C-лиаза
КФ 5 Изо меразы	Внутримо лекулярная перестано вка, то  есть изо меризация мо лекулы субстрата.	AB → BA	эпимераза, цис-транс-изо мераза,внутримо лекулярная о ксидо редуктаза и др.
КФ 6 Лигазы(синтетазы)	Со единение двух мо лекул в результате синтеза но во й C-O, C-S, C-N или C-Cсвязи, со пряжённо е с о дно временным гидро лизо м АТФ.	X + Y+ ATP → XY + ADP + Pi	C-O-лигаза, C-S-лигаза, C-N-лигаза, C-C-лигаза

Согласно  современной классификации и номенклатуре ферментов α - амилаза получила название α-1,4-глюкан-4глюкангидро лаза; β -амилаза - α -1,4-глюкавмальтогидролаза; глюкоамилаза-α-1,4-глюкогидро лаза; олиго -1,6-глюкозидаза декстрин-6-глюкангидролаза.

Роль α-амилаз при гидро лизе крахмала исключительно  велика. Из трех основных функций при действии на клейстеризованный крахмал (разжижение, декстринизация, осахаривание) разжижение и декстринизация зависят о т α-амилаз. Они атакуют не только  клейстеризо ванный, но  и нативный крахмал, разрушая крахмальные зерна.

α-Амилазы различного  происхождения имеют много  общих свойств: хорошо  растворяются в воде или в сильно  разбавленных растворах солей.

Более концентрированные раство ры солей (например, 20 - 30%ные растворы сульфата аммония) вызывают осаждение этих ферменто в, α-Амилазы легко  растворяются в разбавленных растворах этилового  спирта, но  осаждаются при его  концентрации в среде свыше 60%. Белок α-амилаз обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка ферментов колеблется в пределах pH 4,2-5,7. Молекулярная масса солодовой α-амилазы 60000, α-амилаз микроскопических грибов - 45000--50000. Многие из известных ныне α-амилаз получены либо  в высокоочищенном, либо  в кристаллическом виде.

Действуя на целое крахмальное зерно  α-амилаза атакует его , разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е как бы раскладывает зерно  на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с о бразование не окрашиваемых йодом продуктов в основном низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный.

а - ферментативный гидролиз амилозы; б - начальная стадия гидролиза амилопектина; в - конечная стадия осахаривания амилопектина.

Рисунок 1- Стадия гидролиза крахмала α-амилазой

 

В результате воздействия α - амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно  гидролизуются α- амилазо й до  ди- и моносахаридов. Все α-амилазы проявляют наименьшее сродство  к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же амилазы, особенно  грибного  происхождения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко  с образованием небольшого  количества мальтозы и глюкозы.

Ионы кальция оказывают стабилизирующее действие на α -амилазы. Это  впервые было  обнаружено  Воллерштейно м, затем подтверждено  Накамурой. В настоящее время это  явление отмечено  почти для всех амилаз. Однако  теоретически этот вопрос применительно  к промышленному гидролизу крахмала до  сих пор не разработан.

α-Амилаза солода и глюкоамилаза микроскопических грибов являются осахаривающими ферментами, образующими при гидролизе крахмала сбраживаемые сахара- мальтозу и глюкозу соответственно .

β-Амилаза – типичный представитель амилаз высших растений. Ее действие на крахмал, содержащий α -гликозильные связи, ведет к образованию β-мальтозы. Это  явление было  первым признанным примером.

Субстратами для действия амилаз являются крахмал, состоящий из амилозы и амилопектина, продукты частичного  гидролиза крахмала и гликоген.

Крахмал – растительный полисахарид с очень сложным строением. Это  двухкомпонентное соединение, состоящее из 13-30% амилозы и 70-85% амилопектина. Оба компонента неоднородны, их молекулярная масса колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Амилоза - это  неветвящийся полимер, в котором остатки глюкозы со единены α -1,4-гликозидно й связью; степень полимеризации около  2000. В «аномальных» амилозах с одной-двумя α -1,6-связями полимеризация может возрасти до  6000 (рис 2). Амилоза практически не обладает восстанавливающей способностью, так как в каждой молекуле амилозы имеется только  одна свободная альдегидная группа.

Молекула амилозы представляет собой растянутую спираль, шаг которой составляет 10,6 А и в каждый виток входит 3 остатка глюкозы.

Рисунок 2-Строение амилозы

 

 

В растворе спираль сжимается за счет увеличения витка, в котором уже участвует 6 остатков глюкозы. При вхождении молекул йода в спираль амилозы возникает характерный синий цвет. Строго  говорить о  величине молекулы амилозы нельзя, т. е. даже из одного  образца крахмала извлекается амилоза, с величиной молекулы от 500 до  2000 остатков глюкозы. Амилопектин имеет большую молекулярную массу, чем амилоза, и более сложное строение. Это  ветвящийся полисахарид. Предполагается, амилопектин ветвится дихотомически, т. е. число  концевых звеньев всегда на единицу больше числа звеньев, дающих ветвление, а сумма этих чисел дает общее число  звеньев по  всей цепи.

 

1.2 Механизм действия

К группе амилотических ферментов относятся α - и β -амилазы, глюкоамилаза, пуллуланаза, изоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо - и экзоамилазы. Четко  выраженной эндоамилазой является α -амилаза, способная к разрыву внутримолекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата.

Глюкоамилаза и β -амилаза являются экзоамилазами, т.е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего  конца.

При изучении механизма действия амилаз имеются определенные сложности, и прежде всего  они заключаются в том, что  субстрат - крахмал неоднороден и имеет различные характеристики по  степени полимеризации гли-козидно й цепи и количеству ветвлений.

Реакции, катализируемые амилазами, имеют две стадии: короткую -предстационарную и длительную - стационарную. Во  время первой стадии эндоамилаза быстро  уменьшает молекулярную массу субстрата, образуя смесь линейных и разветвленных олигосахаридов. Второй этап реакции продолжается, пока продукты гидролиза не перестанут окрашиваться йодом; он протекает значительно  медленнее и зависит от индивидуальных свойств фермента и его  природы. По этому конечные продукты гидролиза α -амилазами могут быть различными. Первая стадия воздействия фермента на субстрат хотя и носит неупорядоченный характер, имеет для всех видов α -амилаз схожий механизм.

Существует две гипотезы о  механизме действия экзоамилаз на субстрат. Первая гипотеза предполагает, что  воздействуя на субстрат по  одноцепочечному или «молниеобразному» механизму, экзоамилаза образует фермент-субстратный комплекс с захватом нередуцирующего  конца цепи.

Дальнейшее продвижение фермента по  этой цепи происходит до  полного  ее гидролиза. По  второй гипотезе (β - и глюкоамилаза действуют на субстрат путем механизма множественной атаки, т. е. фермент образует комплекс с молекулой субстрата, затем через несколько  этапов этот комплекс распадается и фермент связывается с новой молекулой субстрата. Иными словами, при множественной атаке происходит нечто  среднее между неупорядоченным механизмом и одноцепочечной, «молниеобразной» атакой. Для полного  гидролиза по  этому механизму одна молекула субстрата должна образовывать много  раз фермент-субстратные комплексы. При этом возможен гидролиз нескольких связей в одном каталитическом акте.

Механизм воздействия амилаз на субстрат может быть рассмотрен с нескольких позиций:

1. вид разрываемой связи (α -1,4 или α -1,6);
2. тип воздействия на субстрат (эндо - или экзо -);
3. влияние на скорость гидролиза степени полимеризации субстрата;
4. возможность гидролиза олигосахаридов;
5. способность фермента к множественной атаке субстрата.

Наличие признаков амилаз, отраженных в 3 и 4 позициях, при действии на линейные субстраты может свидетельствовать о  существовании у этих ферментов подцентровой структуры. Вероятно , активный центр амилазы может состоять из неско льких подцентров, каждый из которых может вступать в контакты с глюкозным остатком. Энергия взаимодействия (А), выраженная в единицах свободной энергии (кДж/моль), определяет подцентровое сродство  фермента к субстрату. Это  сродство  индивидуально  и мо жет быть как положительным, так и отрицательным. Вероятность существования подцентровых структур амилаз помогает установить строение активного  центра амилаз, дает более четкое объяснение субстратной специфичности, но  не дает объяснений механизма гидролиза разветвленных субстратов.