Методы анализа глюкозы в субстанции

Валидационные характеристики:

- Правильность

-Прецизионность

-Специфичность

-Предел обнаружения

-Предел количественного  определения

-Линейность

-Диапазон применения

-Робастность

 

Таблица №1 – Валидационные  характеристики основных типов методик

Наименование      характеристики	Типы методик
	Испыта- ние на подлин-ность	Посторонние               примеси		Количественное              определение
		Количест-венные методики	Преде- лысодер-жания	Основного действующ-его  вещества, нормируемых компонентов	Действую-щего веще-ства в  тесте «Растворе-ние»
Специфичность**	Да	Да	Да	Да	Да
Линейность	Нет	Да	Нет	Да	Да
Аналитическая    область	Нет	Да	*	Да	Да
Точность	Нет	Да	*	Да	Да
Прецизионность: -повторяемость (сходимость) -внутрилаборатор- наявоспроиз-водимость	Нет        Нет	Да         Да¹	Нет         Нет	Да            Да¹	Да         Нет
Предел обнару-жения (чувстви-тельность)	Нет	Нет²	Да	Да	Да
Предел количест-венногоопреде-ления	Нет	Да	Нет	Нет	Нет
Робастность (устойчивость)	Нет	*	*	*	*

*может определяться при  необходимости;

** отсутствие специфичности  одной аналитической методики  может быть компенсировано использованием  другой аналитической методики;

¹ необходимо только для  новых методик, не имеющих аналогов

² необходимо в тех случаях, когда предел обнаружения близок к пределу количественного определения 

 

 

 

 

 

 

Глава 2 Валидационная оценка методик анализа глюкозы

 

 

2.1. УСТАНОВЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ

 

Линейность - это наличие прямой пропорциональной зависимости аналитического сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе.

    Линейность выражается  уравнением  y = ax + b. Это уравнение называют линейной регрессией. Параметр bградуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициента характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики.

Расчет коэффициентов  градуировочного графика проводят по формулам и данным таблицы

 

 

В химических методах анализа (титриметрия) аналитик не может повлиять на имени коэффициентов а и b.Однако если при проведении контрольного опыта титрант не расходуется, то градуировочный график принимает форму прямой, выходящей из начала координат, и имеющей тангенс угла наклона равный 1.

Значения параметров а и bвычисляются методом регрессионного анализа. В настоящее время пользуются соответствующими компьютерными программами (например.Excel). Для аналитических целей можно использовать только ту методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с коэффициентом r, который должен быть >0,99.

Расчет коэффициента корреляции r

 

 Для количественного  определения следует использовать  методики с коэффициентом корреляции не ниже 0,99, пересечение с осью Y - не более 2% от величины коэффициента а.

 

Методика анализа:

Точную навеску глюкозы (0,500 г) поместили в мерную колбу  вместимостью 100 мл, растворили и довели водой очищенной до метки, перемешали (раствор А).

В колбы для титрования последовательно внесли 5,0 мл; 10,0 мл; 15,0 мл; 20,0 мл; 25,0 мл полученного раствора А, прибавили в каждую по 15 мл 0,05 М  раствора йода, 3 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрыли склянку пробкой  и реакционную смесь оставили стоять в темном месте 5 минут. Далее  прибавили 6 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором  натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал).

Параллельно проводили контрольный  опыт.

Данные занесли в таблицу.

Таблица 2. Результаты титрования.

Навеска 0,5% раствора глюкозы (мл)	5,0	10,0	15,0	20,0	25,0
V(I2) – V (Na2S2O3), мл
Концентрация раствораглюкозы, г	0,025	0,05	0,075	0,10	0,125

V_k=16,7мл

Vk – V, мл

15,3

15,6

15,9

16,2

16,4

Градуировочный график

Коэффициент корреляции равен  0,997459

Заключение: Рассчитано уравнение  градуировочного графика. Показана линейность методики.

2. 2 АНАЛИЗ ПАРАМЕТРА  ПРАВИЛЬНОСТЬ

 

Правильностью аналитической методики называется степень близости экспериментальных результатов к истинному значению во всей области измерений. Главным фактором, определяющим правильность, является значение систематической погрешности.

 

Для оценки правильности методик  количественного определения активной субстанции применимы следующие  подходы:

1. применение аналитической методики к образцу с известной степенью чистоты, например к стандартному образцу;
2. сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой методики и арбитражного метода, правильность и прецизионность которого известны;
3. заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Для оценки правильности методик  количественного определения готового лекарственного препарата:

1. применение методики к искусственным (модельным) смесям, к которым были добавлены известные количества анализируемого вещества;
2. если невозможно получить образцы всех компонентов лекарственного препарата, возможно применение метода добавок или арбитражной методики, правильность которой доказана
3. заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Далее приведен первый способ определения правильности с использованием модельной смеси.

Для тестирования методики на правильность готовятся модельные  смеси с точным содержанием каждого  из компонентов, включая и вспомогательные  вещества. Согласно рекомендациям ICH необходимо проанализировать не менее 9 образцов на 3 уровнях концентраций. Правильность методики устанавливается в указанном диапазоне ее применения. Для оценки полученных результатов наиболее простым и наглядным критерием служит открываемость (R), которая вычисляется по формуле:

 

При проведении анализа будут  получены 9 значений открываемости.

Для более детальной оценки следует статистически обработать полученные значения R, рассчитав стандартное и относительное стандартное отклонение. Это наиболее простой способ.

Для того чтобы сделать  вывод о полученных результатах, следует иметь ввиду, что для  анализа субстанций с содержанием  действующего вещества не менее 98%, значения правильности должны быть в пределах 99-101%. При анализе субстанций с нормой содержания действующего вещества менее 98%, в пределах 98- 102%. Для лекарственных препаратов с различным содержанием определяемого компонента рекомендуются следующие интервалы правильности

 

Приготовили три модельных  раствора глюкозы А₁, А₂, А₃ по прописям, приведенным в таблице 2.

 

Таблица 2. Приготовление  модельных растворов глюкозы.

 

Модельная смесь	1 (А1)	2 (А2)	3 (А3)
Навеска глюкозы (г)	0,4	0,5	0,6
Воды очищенной	до 10 мл	до 10 мл	до 10 мл

 

Раствор А₁. Точную навеску глюкозы (0,400 г) помещали в мерный цилиндр, растворяли в воде и доводили водой до метки (10 мл).

Раствор А₂. Точную навеску глюкозы (0,500 г) помещали в мерный цилиндр, растворяли в воде и доводили водой до метки (10 мл).

Раствор А₃. Точную навеску глюкозы (0,600 г) помещали в мерный цилиндр, растворяли в воде и доводили водой до метки (10 мл).

Растворы  Б₁, Б₂, Б₃. В три колбы для титрования переносили по 1,0 мл модельной смеси А₁, прибавляли 10 мл воды, 10 мл 0,05 М раствора йода, 2 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрывали колбу пробкой и реакционную смесь оставляли стоять в темном месте 5 минут. Далее прибавляли 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал) (V₂).

Растворы  Б₄, Б₅, Б₆. В три колбы для титрования переносили по 1,0 мл модельной смеси А₂, прибавляли 10 мл воды, 10 мл 0,05 М раствора йода, 2 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрывали колбу пробкой и реакционную смесь оставляли стоять в темном месте 5 минут. Далее прибавляли 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал) (V₂).

Растворы  Б₇, Б₈, Б₉. В три колбы для титрования переносили по 1,0 мл модельной смеси А₃, прибавляли 10 мл воды, 10 мл 0,05 М раствора йода, 2 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрывали колбу пробкой и реакционную смесь оставляли стоять в темном месте 5 минут. Далее прибавляли 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал) (V₂).

Параллельно проводили контрольный  опыт.

1 мл 0,05 М раствора  йода соответствует 9,9 мг водной  глюкозы (или 0,0099 г).

Расчет содержания глюкозы  в процентах (открываемость) проводили  по формуле:

   (1) ,

где: V_к – объем 0,1 М раствора натрия тиосульфата, пошедший на контрольный опыт, мл;

V₂ – объем 0,1 М раствора натрия тиосульфата, пошедший на титрование испытуемого раствора, мл;

T – титр глюкозы;

        а  – навеска, взятая для титрования, мл;

C (A₁, A₂, A₃) – содержание глюкозы в модельных смесях А₁, А₂, А₃ соответственно (0,04 г; 0,05 г; 0,06 г).

Результаты заносили в  таблицу №3 и рассчитывали стандартное  отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD) по формулам:

 

 

R₁ = 100.98

R₂ = 98.46

R₃ = 103.50

R₄ = 100.26

R₅    = 100.98

R₆    = 98.96

R₇  = 97.61

R₈ = 97.01

R₉    = 100.98

 

Таблица 3 – Результаты определения  правильности титриметрическим методом.

 

Взято модельной смеси, мл	Взято лекарственного вещества, г	Объем титранта, мл	R,%	Метрологические характеристики
1,0	0,4	10,0	100,98
1,0	0,4	10,1	98,46
1,0	0,4	9,9	103,50	R=99,86
1,0	0,5	8,9	100,26	SD=2,0102
1,0	0,5	9,0	100,98	RSD=2,0%
1,0	0,5	9,1	98,96
1,0	0,6	8,1	97,01
1,0	0,6	8,2	97,61
1,0	0,6	8,0	100,98