Фармакогностическое изучение листьев ореха грецкого и маркетинговые исследования антимикробных препаратов

где: A – оптическая плотность

a – навеска сырья

w – влажность сырья

Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты количественного определения суммы нафтохинонов в листьях ореха грецкого

Навеска сырья, г	A	X %	Метрологические характеристики
0,1530	0,542	0,51	= 0,50% S = 0,0175 S = 0,0071 ∆X = 0,0184 t = 2,57, P = 95 ε = 3,65%
0,1509	0,525	0,50
0,1468	0,492	0,48
0,1475	0,504	0,49
0,1524	0,540	0,51
0,1569	0,575	0,53

 

Как следует из данных, представленных в таблице, содержание суммы нафтохинонов в пересчете на юглон в листьях ореха грецкого составило 0,50±0,02. Относительная ошибка метода составила 3,65%.

4. Стандартизация листьев ореха грецкого

По результатам проведенных  исследований нами предложены следующие нормы качества листьев ореха грецкого.

Таблица 5 – Нормы качества листьев  ореха грецкого

Показатель	Метод	Результат
Внешний вид	Визуальный	Соответствие  диагностическим признакам
Микроскопия	Микроскопический	Соответствие  диагностическим признакам
Качественный анализ	ТСХ в системе петролейный эфир  - диэтиловый эфир (10:3,5)	Присутствуют зоны адсорбции с Rf  = 0.38 (юглон), 0,83 (β-каротин), 0,49 (хлорофилл)
Количественный анализ суммы нафтохинонов в пересчете на юглон	Фотоколориметрия	Содержание 0,5±0,02% в пересчете на абсолютно-сухое сырье
Влажность	ГФ XI	Не более 10%
Зола общая	ГФ XI	Не более 10%

Предложенные критерии позволяют  проводить сквозную стандартизацию сырья и предложенных на его основе лекарственных препаратов.

Выводы по главе

Определены основные числовые показатели листьев ореха грецкого.

Методом ТСХ и денситометрии  идентифицированы основные биологически активные вещества: юглон, хлорофилл, b-каротин.

Предложена методика фотоколориметрического определения суммы нафтохинонов в пересчёте на юглон, содержание которой составляет около 0,4%.

Разработаны критерии оценки качества листьев ореха грецкого.

 

4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДОВ АНАЛИЗА МАСЛЯНОГО ЭКСТРАКТА ЛИСТЬЕВ ОРЕХА ГРЕЦКОГО

1. Технологическая схема получения масляного экстракта 

листьев ореха  грецкого

ВР.1. Санитарная подготовка производства

ВР 2. Подготовка сырья и материалов.

ТП 3. Получение экстракта

УМО 4. Фасовка и упаковка.

ВР.1. Санитарная подготовка производства

ВР.1.1. Подготовка вентиляционного  воздуха

Подготовка вентиляционного воздуха, включая обслуживание вентиляционных установок, обработку поверхностей фильтрующих камер и воздуховодов, осуществляется согласно рабочим инструкциям. Чистота воздуха (количество микроорганизмов в 1 м³) должна соответствовать нормам, установленным соответствующей документацией. Внутренние и наружные поверхности фильтрокамер и воздуховодов вентиляционных установок производственных помещений должны иметь покрытие, допускающее их обработку дезинфицирующим раствором.

ВР.1.2. Подготовка производственных помещений

Перед началом производственного  процесса производят генеральную уборку. При этом помещение обрабатывают дезинфицирующим раствором, представляющим собой 3 % раствор перекиси водорода с 0,5 % синтетическим моющим средством «Прогресс» или 1-2 % раствор хлорамина с температурой от 40 до 50^оС. Весы, разновес, коррозирующие части оборудования, электроосветительную аппаратуру протирают ветошью или салфеткой, смоченной дезраствором. Ежедневно перед началом работы производят дополнительную обработку помещений.

ВР.1.3. Подготовка технологического оборудования

Приступая к работе, проверяют:

1. Отсутствие в емкостях продукта от предыдущей серии.
2. Исправность запорной арматуры, плотность фланцевых соединений и сальниковых уплотнителей.
3. Заземление аппаратуры и коммуникаций.
4. Ограждение вращающихся частей оборудования.

Перед загрузкой каждой новой серии  моют емкости, меняют фильтровальные материалы. Емкостное оборудование снабжают биркой с указанием находящегося в нем препарата или полупродукта и его физико-химических данных.

Периодическая чистка и дезинфекция  оборудования должна производиться согласно графику с применением 1 % раствора дегмина или 3 % раствора пероксида водорода с добавлением 0,5 % раствора моющего средства с последующей промывкой теплой и холодной водой.

ВР.1.4. Подготовка персонала

Все лица, занятые в производстве лекарственных средств, должны пройти предварительное медицинское освидетельствование  и бактериологическое обследование в соответствии с «Инструкцией по проведению обязательных профилактических и медицинских обследований лиц, поступающих на работу». Для работы в производственных помещениях используют технологическую одежду. Строго ограничивается вход в производственные помещения и выход из них. Для мытья рук используют туалетное мыло, а для их обработки 1 % раствор дегмина. Контроль микробной обсемененности рук работающего персонала должен проводиться с помощью смывов тампонами

ВР 2. Подготовка сырья  и материалов.

ВР.2.1. Подготовка посуды

Флаконы, крышки и полиэтиленовые пробки загружают в ванну. Заливают тёплой водой (30-40°С) и моют вручную. Грязную воду сливают в канализацию, а флаконы и крышки несколько раз ополаскивают в чистой воде, укладывают на противни и сушат в сушильном шкафу при температуре 80-90°С в течении 4-5 часов. После визуального контроля чистоты флаконов, крышек и пробок, их передают на противнях на стадию УМО.4.1.

ВР.2.2. Отвешивание и отмеривание компонентов

Все исходные компоненты масляного экстракта, поступающие в производственный отдел, должны быть предварительно проверены аналитической лабораторией на соответствие действующей инструкции и нормативно-технической документацией на них. Отвешивание сырья проводят в индивидуальной таре на технических весах. Воду очищенную отмеривают мерником.

 ТП 3. Получение экстракта

ТП.3.1. Экстрагироование сырья хпороформом на установке типа «Сокслет»

Подготовленное сырьё загружают  в технологическую ёмкость-экстрактор установки типа «Сокслет» и заливают определённым количеством хлороформа. Экстрагирование начинают с предварительного настаивания, затем при нагревании до 60-70C производят циркуляцию экстрагента до полного истощеиия сырья, далее из перегонного куба отгоняют часть экстрагента, получая концентрат.

ТП.3.2. Удаление экстрагента

Полученная вытяжка подаётся на вакуум-выпарной аппарат, где после удаления экстрагента получают пасту.

ТП.3.3. Приготвление масляного раствора из полученной пасты

Полученную таким образом пастообразную  массу растворяют в растительном масле в соотношении 1:10 при нагревании до55-60C и перемешивании.

ТП.3.4. Стандартизация

Полученный экстракт стандартизуют  по содержанию нафтохинонов в пересчете  на юглон.

УМО 4. Фасовка и упаковка.

УМО.4.1. Фасовка препарата

Экстракт фасуют по массе в чистые банки. Банки вручную укупоривают пробкой полиэтиленовой и крышкой навинчивающейся.

УМО.4.2. Упаковка и маркировка готовой продукции

На каждую банку наклеивают этикетку с указанием предприятия-изготовителя, его товарный знак, название препарата  на латинском и русском языках, состав препарата, количество, способ применения, условия хранения, регистрационный номер, номер серии, срок годности.

2. Оценка качества масляного экстракта листьев ореха грецкого

Оценку качества масляного экстракта  листьев ореха грецкого проводили согласно требованиям ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» [17].

Описание

Масляный экстракт ореха грецкого — вязкая прозрачная жидкость тёмно-зелёного цвета с желтоватым оттенком с характерным запахом и вкусом.

Качественный анализ

Качественный анализ основных биологически активных соединений проводили методом тонкослойной хроматографии.

Методика: экстракт растворяли в хлороформе в соотношении 1:1, перемешивали, наносили пробу на хроматографическую пластинку «Сорбфил», предварительно проведя линию старта и хроматографировали в системе растворителей петролейный эфир – диэтиловый эфир в соотношении 5:2 в герметичной камере. По достижении растворителем 3-ёх см до края пластинки её извлекали и отмечали линию финиша. Идентификацию хлорофилла проводили по характерному свечению в УФ-свете, каротиноиды – обработкой хроматограммы раствором фосфорно-молибденовой кислоты (синие окрашивание), юглон – по собственной окраске.

 

Рисунок 17 – Технологическая схема производства масляного экстракта

 

Количественное определение 

Количественное определение суммы  нафтохинонов проводили методом фотоколориметрии.

Методика: 1 мл экстракта помещали в мерную колбу на 100 мл, растворяли в хлороформе, доводили до метки, перемешивали и определяли оптическую плотность на КФК-3-01 в кювете толщиной 10 мм при длине волны 430 нм относительно хлороформа. Содержание суммы нафтохинонов в пересчёте на юглон определяли по калибровочному графику.

 

Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Результаты количественного определения

Объём экстракта, мл	A		Содержание суммы нафтохинонов	Метрологические характеристики
1	0,348	0,17865		= 0,18% S = 0,001 S = 0,0004 ∆X = 0,001 t = 2,57, P = 95 ε = 0,54%
1	0,350	0,17952
1	0,347	0,17784
1	0,345	0,17672
1	0,348	0,17865
1	0,348	0,17865

 

3. Оценка антимикробной активности масляного экстракта листьев ореха грецкого

В многочисленной литературе неоднократно сообщалось о противомикробной активности извлечений из различных частей растения. Нами было проведено исследование с целью подтверждения этого факта.

Методика исследования:

Антибактериальное действие полученных извлечений определяли способом «колодцев». Способ основан на диффузии испытуемых веществ из «колодцев» в питательный агар, засеянный различными тест-культурами. Этот принцип диффузии положен в основу фармакопейного метода определения антимикробной активности антибиотиков.

При выполнении метода толстый слой агара в чашках Петри засевали 2 мл 100-млн взвесей суточных тест-культур, излишек взвесей удаляли, чашки подсушивали; сверлом диаметром 6 мм пробуравливали отверстия («колодцы») на расстоянии 2,5 см от центра и на одинаковом расстоянии друг от друга. Колодцы заполняли исследуемыми извлечениями и растворителями (контроли). Через 16-18 часов инкубации в термостате измеряли диаметры зон отсутствия или угнетения роста [21].

В результате исследования масляного экстракта и сухого извлечения липофильной фракции листьев ореха грецкого (с растворителем ДМСО). Для определения антимикробной активности были использованы следующие тест культуры: Staphylococcus aureus 209; S. aureus (Макаров); S. aureus Type; S. epidermidis Wood -46; Escherichia coli 675; E. coli 0-55; Salmonella gallinarum; Proteus vulgaris; 9- Pseudomonas aeruginosa; Bacillus subtilis L2; Вас. anthracoides-96; Вас. anthracoides-1. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.