Генетикалық инженерия негіздері

В. А. Энгельгардтың басшылығымен «ревертаза» жобасы жасалған. Осы ферменттің көмегімен гендер синтезделеді. Бұл жобаны іске асыру үшін көптеген инситуттар, сондай – ақ ЧССР және ГДР ғылым академиялары қатысты. Осының нәтижесінде 1974-1978 жылдар арлығында көгершіннің, үй қоянының және адамның глобин гені, сонымен қатар тышқанның бауыр митохондриясының гені, иммундық белок генінің бөлшектері және т.б. гендер синтезделді. Ревертазаның көмегімен синтезделген гендердің реттеуші учаскесі болмайды, сондықтан олардың қалыпты жұмыс істеуі үшін реттеуші элементтер жалғау керек. Ол элементтер химиялық синтез жолымен немесе бактерия клеткаларынан алынады, бұның өзі едәір қиындыққа соғады. Жоғарыда айтылған әдістерден басқа, генді трансдукция фагтарының көмегімен алуға болады. Бұл әдіспен 1969 жылы Дж. Беквитц бірінші рет лактоза генін (лакген) ішек таяқшасынн бөліп алды. Алайда бұл әдіс үнемі қолдануға жарамсыз, себебі ол фагтыбелгілі бір жерге орналастыруды талап етеді. Сондықтан еректі гендерді тасымалдауға қолайлы векторларға орналастырып көбейтіп, клетка – реципиенттер құрамына кіргізеді.

-10-

І.2 Рестрикция ферменттері

Рестрикциялау – модификациялау құбылысы 50 – ші жылдары байқалған болатын. Рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді, ал модификация – молекуланың белгілі топтарын химялық жолмен немесе оларға басқа топтарды жалғау арқылы өзгерту. Рестрикция мен модификациялау құпиясын 1962 жылы В. Арбер ашты.

Бактерияның «өзінің» нуклеин қышқылын «бөтен» фагтардың (вирустардың) нуклеин қышқылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның клеткада көбеюіне жол бермейді. Рестриктазалармен қатар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияның өзінің ДНҚ тізбегіндегі азоттық негіздерге белгілі мөлшерде әрбір репликациядан кейін метил тобын (CH3) жалғап, модификациялап отырады. Метилденген ДНҚ – ны рестриктаза «өзінікі» санап, оған «тиіспейді». Бұл бактериялардағы өзіндік бір «иммундық жүйе» іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагтың кейбір нуклеин қышқылы кездейсоқ метильденіп кетеді. Осы қателігінен бактерияның өзі фагтың әсерінен қырылып кетеді. Осы құбылысты Haemophilus influnzae штаммынан Х. Смит, Д. Натанс және В. Арбер 1970 жылы ашты. Ол Hind ІІІ деп белгіленді. Рестриктазалар табиғаттың ген инженериясына жасалған таптырмас құралы. Бактерия әр түрлі болғандықтан олардың рестриктазалары ДНҚ – ны әр түрлі жолмен үзеді. Қазір 400 – ден аса рестриктаза түрі белгілі және олар ДНҚ – ны бір – бірінен өзгеше 120 жерінен үзе алады. Яғни зерттеуші рестриктазаны таңдай отырып, ДНҚ – дан қалаған ферментті немесе генді бүлдірмей бүтін күйінде кесіп алады. Генді бөліп алу мен ген өркенін (клондарын) алу үшін әр түрлі объектілер (бактериялардан, сүтқоректілер клеткаларынан, құстардан т. б. алынған) және вирустар жұқтырылған ортада өсірілетін ерекше ферменттер құрал ретінде пайдаланады. Негізінде олар үш түрлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза және кері транскриптаза.

Рестриктазалар – дезоксирибонуклеазалардың ДНҚ молекуласын қысқа немесе ұзын бөлшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір түрі. Рестриктазалардың ерекшеліктері ДНҚ молекуласын  кез келген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. Әрбір  рестриктазаның таңдайтын нуклеотидтер орналасу тәртібі бар. Сондықтан рестриктазалар ДНҚ – ны бірнеше жүздеген немесе мыңдаған нуклеотидтер жұптарынан тұратын бөлшектерге үзеді.

Рестриктазалардың үш класы белгілі, олар өзара ДНҚ – ны тану үшін және үзілген жерін білу, белок құрылымы және реакцияға түсу үшін қажетті шартты анықтауы бойынша өзгешеленеді. Ген – инженерлік жұмыстарында ДНҚ – ның қос тізбегін таныған учаскесінің зонасында үзетін екінші кластағы ферменттер қолданылады. әдетте фермент 4-6 нб тұратын ерекше жүйелілікті таниды, ол палиндром (гр. «palindromeo» - артқа жүгіру, яғни алға да артқа қарайда бірдей оқылу керек) және оны ортасынан немесе одан шеткерірек кеседі. Соңғы жағдайда бір тізбекті ұштар пайда болады, оларды «жабысқақ» деп атайды. Мұндай бір рестриктазаның әсерінен пайда болған ұштар негіздердің комплементарлығына сай өзара будандаса алады.

                                            -11-

Бұл әр түрлі ДНҚ молекулаларының болашақта бірігу мүмкіншілігін туғызады.

Рестрикция ферменттері бөлініп алынған организмнң атымен белгіленеді. Бактерияның түрінің үш әріпін пайдаланады, мысалы, Bgl ІІ - Bacillus globidi, Eco RL – E.coli, Hind ІІІ – Haemophilis influenzae т.с .с. Үш әріптен кейін курсивпен әріптік бейне (символ) беріледі, ол генетикалық линиясын немесе штаммды білдіреді.

Лигаза – ДНҚ – ның бос ұштарын бір – біріне жалғайтын фермент. Бұл фермент қалыпты клеткаларда ДНҚ синтезіне және репарация (қалпына келу) процестеріне қатысады, яғни ДНҚ молекуласының біраз бүлінген жерлерін қалпына келтіруге қатысады.

Кері транскриптаза – ДНҚ – полимераза тәріздес фермент. Бірақ ДНҚ – ны ДНҚ – дан емес РНҚ – дан синтездейді. РНҚ – полимеразамен салыстырғанда, ол кері бағытта жұмыс істейді, яғни ДНҚ – дан РНҚ – ға емес, РНҚ – дан ДНҚ – ға. Кері транскриптаза ферментінің қалыпты сау клеткалары бар ма, және оларда ДНҚ синтезі РНҚ – да жүре ме ? Бұл күмәнді сұрақ әлі толық шешілмеген. Алайда бұл фермент, эукариот клеткаларында оларға ДНҚ арқылы көбейетін РНҚ – сы бар вирустарды жұқтырғаннан кейін пайда болады. Бұл вирустардың геномы кері транскриптазаны кодтайды, соның көмегімен вирустың ДНҚ үлгісі құрылады да, кейін вирустар молекулаларының РНҚ – сы синтезделеді.

ДНҚ рекомбинанттары (будан ДНҚ – лар)

Генетикалық рекомбинацияның мәні – екі хромосоманың өзара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан көп тұқым қуатын анықтауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына әкеп соғатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті түрде сүтқоректілердің жыныс клеткалары пайда болғанда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендерімен алмасады (кроссинговер – айқасу құбылысы). Осы алмасулар ұрпақтарға берілетін тұқым қуатын белгілердің араласуын түсіндіруге мүмкіндік береді.

Гендер алмасуын, сондай – ақ клеткаға «бөтен» генді енгізуді генетикалық рекомбинация арқылы in vitro организмнен тыс жасауға болады.

1972 жылы  П.Бергтің лабораториясында (АҚШ, Станфорд университеті) ең бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның құрамына лямбда бактериофагының геномы мен SV 40 вирус геномы кірді. Организмнен тыс рекомбинация әдісі, әр түрдің ДНҚ – ларын (табиғи немесе жасанды) бөліп алып, оларды бір – бірімен қосуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ – ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын, мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді.

                                           -12-

Ген инженериясы негізінде биотехнологиялық өнімдер алу

Қазіргі кезде тек ген инженериясы ғана адамға қажетті биологиялық активті заттарды химиялық таза күйінде алуды қамтамасыз ете алады. Ген инженериясының қарқынды дамуы арқасында адамның бірқатар ауруларын (генетикалық аурулар) емдеу және ауылшаруашылық малдарының өнімділігін жоғарылату мүмкін болды. Алғаш рет медицинада ген инженериясының өнімі – инсулин қолданды. Инсулин ұйқы безінде түзіледі, оның арқасында қандағы глюкозаның артық мөлшері жануар текті крахмал гликогенге айналады. Ұйқы безінде инсулиннің түзілуі бұзылатын болса, адам диабет ауруына ұшырайды, яғни қанда жүзім қантының мөлшері артады. Есептеу бойынша дүние жүзінде 60 млн. адам диабетпен ауырады. Диабетпен ауыратын адам тәулігіне гормонның орта есеппен 40 бірлігін қабылдауы қажет. Осы уақытқа дейін инсулиннің негізгі шығу көзі – етке өткізілген сиыр мен шошқаның ұйқы безі болатын. Ауру адамдардың біраз бөлігі, әсіресе балаларда бұл гормонға аллергия дамығандықтан, оларды жануар текті гормонмен емдеу қиын болды және де инсулинге тәуелді адамдардың саны жылдан жылға арта түсуде. Осы себептерге орай адамның ген инженерлік инсулиннің бактерия клеткасында өндіру қажеттігі туды.

Адам инсулині генін алғаш рет 1978 ж. «Генентек» фирмасы (АҚШ) синтездей алды. Соматостатин гені сияқты инсулиннің синтетикалық гені плазмидаға бетта – галактозидаза генінің соңына енгізілді. Мұнда әрбір бактериялық клеткада инсулиннің шамамен 100 мың молекуласы синтезделді. E.coli клеткасында проинсулиннің биосинтезі іске асты, ол үшін кері транскиптазаның көмегімен иРНҚ – да оның ДНҚ көшірмесі синтезделді. Америкалық «Эли Лилли» фирмасының зерттеушілері  E.coli клеткасының 20% көлемін проинсулин немесе инсулин алатынын атап көрсетті. Көлемі 100 л бактерия культурасынан 200г дейін инсулин өндіруге болады, әншейінде гормонның мұндай мөлшерін өндіру үшін сиырдың немесе шошқаның 1600 кг ұйқы безін өңдеу қажет болар еді. Ұлыбритания мен СССР – де  рДНҚ технологиясы арқылы бактерия клеткасында инсулин өндіру 1980 ж ойдағыдай шешілді.

Инсулинен кейін ген инженерлік фармокология соматотропин деп аталатын өсу гормонын бактериялық клеткада синтездеуді шындап қолға алды. Адамдарда соматотропин гипофиздің алдынғы бөлігінде синтезделеді, оның жетіспеушілігі гипофиздік ергежейлікке әкеледі. Көп уақыт бойы соматотропинді өліктерден бөліп келді. Алайда, дамыған елдерде осындай жолмен бөлінген гормон гипофиздік ергежейлілікпен ауыратын адамдардың тек үштен біріне ғана жеткілікті болды. Бұдан басқа, өліктерден бөлінген гормонның қоспасы көп болғандықтан, препарат қабылдаған аурулардың 30 % гормонға қарсы антизаттар синтездейді, мұның өзі гормонның активтілігін жоққа шығарды.

                                        -13-

Швецияның «Каби битрум» фирмасы 1978 ж. «Генентек» компаниясымен ген инженериясының әдісі арқылы соматотропинді синтездей алатын бактерия штамын алу үшін келісімге қол қойды. 8 айдан соң  «Генентек» фирмасының зерттеушілері – Дж. Геддель және т.б. соматотропинді синтездей алатын E.coli К12 штаммын алды. Алайда, алынған синтетикалық гормонның N – ұшында метиониннің қосымша қалдығы болды. 1980 ж. «Генентек» компаниясының зерттеушілері қосымша метионині бар синтетикалық гормонның биологиялық активтілігі табиғи соматотропиннен кем түспейтін дәлелдерін FDA – ға ұсынды. 1985 ж. соңынан бастап «Каби битрум» компаниясы өсу гормонын сомтрем деген аталумен Стренгнестегі өзінің зауыттарының ферменттерлеріне (әр қайсысының сыйымдылығы 1500л) кең өндірістік масштабта шығаруда.

Ал, 1987 ж. «Эли Лилли» фирмасы рекомбинантты ДНҚ негізінде метионині жоқ яғни табиғи гормоннан айнымайтын өсу гормонын өндірістік негізде шығаруды бастады. Бұл, 191 амин қышқылынан тұратын синтетикалық гормон хуматроп деген комерциялық атаумен белгілі.

Қазіргі кезде Жапония, Канада, Англия және Францияда рекомбинантты соматотропинді бактериялық клетка арқылы өндірістік жағдайдаөндіру кең жолға қойылған.

Рекомбинантты  ДНҚ әдістерін пайдаланып, организм өсуінің басқа факторларын (соматостатин, соматомедин т.б.) синтездеуге болады.  Соматостатин генінің өнімін E.coli клеткасынан лак – апейронды қолданып, бөлу мүмкіндігі бар. Адамда гипофиздің аденомасында акромегалия ауруы (жақ және жіліктердің шеміршек ұштарының сәйкессіз өсуі дамиды). Аурудың себебі, соматотропиннің мөлшерден тыс синтезделуінен болады. Міне, осындай ауруды рДНҚ негізінде алынған соматостатинмен емдеудің пайдасы өте зор.

Мал шаруашылығындағы ген инженериясының маңызды жетістіктерінің бірі болып ген – инженерлік соматотропинді зоотехнияда қолдану саналады. Бұл күрделі поли функциялық белок мал шаруашылығында екі бағытта қолдану алды: 1) малдың өсуін стимуляциялау үшін (соматогендік активтілік); 2) сүт бездерінің қызметін жақсарту үшін (лактогендік активтілік). Яғни соматотропин препараты малдың өсуін жеделдету және сауын сиырдың сүттілігін жоғарылату үшін қолданылады. Өсу гормонының соматогендік пен лактогендіктен басқа екі физиологиялық активтілігі бар: инсулиндік және диабеттік.

Қазіргі кезде ген инженерлік әдіс арқылы ірі қараның, қойдың, шошқаның және тауықтың соматотропин гені алынды және оның   E.coli клеткасындағы клонын алу және экспрессиясы іске асты. Мұқият жүргізілген зерттеулер ірі қараның бактериялардан алынған соматотропині сауын сиыр сүттілігінің артуына ықпал ететінін дәлелдеді. Малға тәулігіне 13,5 тен

                                              -14-

40,5мг дейін  соматотропинді енгізгенде, сиырдан  алынған сүт мөлшері препараттың  мөлшерімен малдың күтіміне байланысты 10 нан 50 % ке дейін көтерілді. Осы  биотехнологиялық өнімді ірі қара сүт шаруашылығында жаппай қолдану кейбір ғалымдардың (Т. Аткинсон және т.б., 1985; Д. Бауман, Маг Гутчеон,1985) пікірі бойынша сиыр сүттілігін орта есеппен 23 – 31 % ке көтереді. П. Баттери өз қызметкерлерімен ұзақ уақыт бойы (188 күн) соматотропин қабылдаған сиырлар сүтінің сапасы бақылау тобынан ешқандай айырмашылығы жоқ екендігін дәлелдеді. Бұдан соматотропин малдың басқа физиологиялық белгілеріне зиянды әсер бермеді.

Алдыңғы қатардағы биотехнологиялық фирмалар (мысалы Дженерал Диагностик Корп, АҚШ ) рекомбинантты ДНҚ технологиясы арқылы мал өсуін реттейтін белокты заттарды шығаруды бастады. Мысалы, протеаза ингибиторлары белоктың ыдырау жылдамдығын бәсеңдетуі арқылы малдың ет массасының көбеюіне себепші болады. Белоктық препарат бетта – агонист май қыртыстарын азайтып, ет ұлпасының түзілуін күшейтеді.

Гендік инженериясының әдістері медицина үшін қан факторлары мен иммуномодуляторларын (Интерферон және интерлейкин) алу үшін кеңінен қолданылады. Интерферон адам және жануар клеткаларында инфекциялық вирустарға қарсы синтезделеді. Олардың антивирустік активтілігі бар, сонымен қатар қатерлі ісіктердің (рак) көбеюін тоқтата алады. Интерферонның үш түрін ажыратады: альфа – интерферон лейкоциттерде вирустарға қарсы түзіледі; бетта – интерферон – фиборбластарға вирустар әсер еткенде түзіледі және иммундық деп аталатын гамма интерферон, Т – лимфоциттерде вирустық немесе бактериялық антигендерге және қатерлі ісіктерге қарсы синтезделеді.

Лейкоциттік альфа – интерферонды алғаш рет 1980 ж. «Биоген» компаниясының зерттеушілері Гилберд пен Вейссман және Фин ғалымы Кантелл генетикалық құрастырылған ішек таяқшасы бактериясынан алды. Лейкоциттік интерферонның генін алу үшін Синдай вирусымен жұқтырылған лейкоцит клеткаларына иРНҚ фракцияларын бөледі. Ревертаза арқылы синтезделген қтДНҚ ұшына олиго – dГ жалғайды, ал рестриктаза Pst І арқылы үзілген pBR322 плазмидасының ұшына олиго-dЦ жалғайды. Pst І бойынша ендірме плазмиданың tet генін инактивациялайды. Сондықтан рДНҚ енген гибридті клеткаларды алғашқы сұрыптау тетрациклинге төзімділік бойынша өтеді. Лейкоциттік альфа – интерферонның геномында интрон бөліктері жоқ және де глюкозаланбаған. Осыған байланысты  альфа – интерферонның рекомбинантты генінің экспрессиясын E.coli клеткасында іске асыру қиын емес. Ал, геннің өзін кері транскрипция арқылы синтездеу өте күрделі, өйткені интерферон иРНҚ – ның мөлшері тіпті лейкоциттердің өзінде жеткіліксіз. 1982 жылы М.Н. Колосов тобы адамның альфа – интерферонының синтетикалық генін синтездеп, оған бактериялық реттеуші элементтерін жалғау арқылы геннің E.coli клеткасындағы экспрессиясын бақылады.