Клеточная и генная инженерия

стоящей из фрагментов разных молекул ДНК: вирусной, бактери-

альной  и  фаговой. Работа была выполнена американским ученым

Полом Бергом с сотрудниками  и  ознаменовала рождение новой от-

расли молекулярной биологии -  генной   инженерии .

В нашей стране первым ученым, который поверил в перспек-

тивность  генной   инженерии   и  возглавил исследования в этой облас-

ти был академик А.А.Баев.

Генетическая, или  генная ,  инженерия , по его определению, -

это конструирование in vitro функционально активных генетических

структур (рекомбинантных ДНК), или, иначе, - создание искусст-

венных генетических программ. Целью  генной   инженерии  является

изучение тонких механизмов функционирования генетического ап-

парата эукариот, включая человека, которые другими путями иссле-

довать невозможно. Вместе с тем,  генная   инженерия  ставит перед

собой обширные практические задачи, немало из которых уже ре-

шено. Прежде всего это получение путем бактериального синтеза

ряда лекарственных средств, например, инсулина, интерферонов.

Важнейшим достижением является создание диагностических пре-

паратов, в частности, для выявления такого опасного заболевания

как СПИД. Получение так  называемых трансгенных растений от-

крывает принципиально новые возможности для растениеводства в

создании сельскохозяйственных культур, устойчивых к экстремальным воздействиям  и  инфекционным поражениям. Это далеко не полный перечень практических свершений  генной   инженерии .

После первых успешных экспериментов  с рекомбинацией мо-

лекул ДНК в пробирке появились первые сомнения  и  опасения, не

принесет ли  генная   инженерия  вред природе  и  человечеству. В июле

1974 года несколько крупных  ученых обратились к научной обще-

ственности с предложением наложить мораторий на работы с ре-

комбинантными ДНК in vitro. В феврале 1985 года в Калифорнии на

Асиломарской конференции собрались 140 ученых разных стран,

работающих в области  генной   инженерии . Всесторонне изучив ре-

зультаты  и  возможные последствия, ученые пришли к выводу, что

потенциальные опасности  невелики, так как рекомбинантные

штаммы в природных  условиях нежизнеспособны  и  их бескон-

трольное распространение маловероятно. Было решено прервать мораторий  и  продолжить исследования с соблюдением специально

разработанных правил. Сегодня  мы можем отметить, что почти за

четверть века своего существования  генная   инженерия  не причини-

ла никакого вреда самим  исследователям, не принесла ущерба ни

природе, ни человеку. Свершения  генной   инженерии  как в познании

механизмов функционирования организмов, так  и  в прикладном

плане весьма внушительны, а перспективы поистине фантастичны.

 

Теоретические основы  генной   инженерии 

 

Молекулярная биология заявила  о себе в качестве самостоя-

тельной науки в 1953 году, когда Джеймс Уотсон  и  Френсис Крик

открыли знаменитую двойную  спираль ДНК и постулировали  мат-

ричный механизм ее синтеза.

В соответствии с этим механизмом двойная спираль ДНК при

репликации разделяется и каждая цепь служит матрицей для синтеза

дочерней цепи, которая  по своей первичной структуре  является зер-

кальным отражением матрицы. В результате такого матричного

синтеза образуются две совершенно идентичные двуспиральные

молекулы ДНК, каждая из которых  передается в дочерние клетки.

Последние получают всю генетическую программу от родительской

клетки. По такому же матричному механизму осуществляется син-

тез РНК, только РНК синтезируется  в виде односпиральной цепи,

которая комплементарна ДНК-матрице. Этот процесс получил на-

звание транскрипции. Процесс синтеза белка на РНК-матрице (м-

РНК) происходит на рибосомах, и структура белка соответствует

структуре м-РНК. Это очень  сложный процесс, он называется

трансляцией, и в нем  участвует транспортная РНК (т-РНК). Она

доставляет в рибосому аминокислоты и адаптирует язык м-РНК  к

языку белка. Таким образом, процесс матричного синтеза ДНК  оп-

ределяет передачу наследственной информации от родительской

клетки в дочернюю. В процессе матричного синтеза РНК происхо-

дит передача информации о первичной структуре белка от ДНК на

м-РНК, а м-РНК переносит  информацию на рибосому, где она  реа-

лизуется в виде конкретной структуры белка.

Следующее важное открытие, предопределившее возникнове-

ние  генной   инженерии , - обнаружение в бактериальных  клетках 

внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК. Эти мини-

хромосомы были обнаружены в начале 50-х годов  и  получили на-

звание плазмиды. Плазмиды обладают способностью к автономной

от хромосомы репликацией, поэтому плазмиды содержатся в клетке

в виде нескольких копий. Различаются  плазмиды по генетическим

детерминантам. Очень важно, что плазмиды из-за своих маленьких

размеров могут быть выделены из клеток неповрежденными.

В 1970 году американские ученые Келли и Смит с сотрудника-

ми выделили первую рестриктазу - фермент, который вызывает гид-

ролиз ДНК в строго определенных местах. Место, в котором рест-

риктазы разрывают ДНК определяется последовательностью, как

правило, из 6-8 нуклеотидов. В настоящее время описано  более 300

различных рестриктаз. Многие из них применяются в генной инже-

нерии. Таким образом к началу 70-х годов были сформулированы

основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и бел-

ков в живом организме  и созданы теоретические предпосылки  ген-

ной инженерии.

На самом деле наряду с  информацией о структуре белка, запи-

санной с помощью генетического  кода, для успешного проведения

синтеза белка, молекула ДНК  должна иметь ряд регуляторных сиг-

налов, записанных в виде специфических нуклеотидных последова-

тельностей. Эти последовательности указывают точки начала транс-

крипции и трансляции и указывают точки прекращения считывания

генетической информации. Генетический код, по-видимому, уни-

версален для всех живых организмов, иными словами, данная по-

следовательность нуклеотидов обязательно кодирует один и тот же

белок в клетках разных организмов, тогда как регуляторные сигна-

лы в клетках животных и бактериальных клетках неодинаковы. Ге-

ны эукариотических организмов имеют мозаичную структуру. Ко-

дирующие белок участки (экзоны) разделены не кодирующими уча-

стками (интронами). В клетках эукариот информационная РНК, ко-

торая транскрибируется с гена, кодирующего белок, подвергается

расщеплению ферментами эндонуклеазами. В результате этого про-

цесса из м - РНК удаляются все интроны, а экзоны в строго опреде-

ленной последовательности сшиваются при помощи лигазы. Этот

процесс получил название сплайсинга. В результате сплайсинга и

последующего созревания м - РНК обладает непрерывной последо-

вательностью нуклеотидов, кодирующей последовательность ами-

нокислот белка, а также содержит все регуляторные сигналы, необ-

ходимые для начала и прекращения трансляции.

 

Методы  введения ДНК в бактериальные  клетки

 

Для введения чужеродной ДНК  в клетки бактерий использу-

ются два метода. Первый основан на использовании плазмиды в ка-

честве вектора. Для трансформации плазмиды в бактериальную

клетку, культуру клеток Escherichia coli обрабатывают солями каль-

ция и кратковременно нагревают до 42 С с последующим резким

охлаждением до 0 С. Это приводит к модификации  структур по-

верхностного аппарата клетки, и клетки активно захватывают плаз-

миды. Однако, далеко не все клетки получают плазмиду. Чтобы от-

личить трансформированные клетки от нетрансформированных, в

геном плазмиды вводят гены, кодирующие устойчивость к различ-

ным антибиотикам. Бактерии, имеющие такие гены, способны расти

на средах содержащих соответствующий  антибиотик. После завер-

шения трансформации клетки Escherichia coli помещают в чашку

Петри с агаризованной средой, в которую добавлен, например, ам-

пицилин. Клетки, не получившие плазмиду, и соответственно, ген

устойчивости  к ампицилину погибают. Клетки же содержащие

плазмиду выживают и дают начало колонии, все клетки которой со-

держат плазмиды. Для того, чтобы клетки Escherichia coli случайно

не утратили плазмиду, их постоянно культивируют на среде, содер-

жащей антибиотик. Так как до трансформации в плазмиду был

встроен какой-нибудь ген  эукариотической клетки, получается, что

все бактерии такой  культуры его содержат.

Второй метод, которым  исследователи пользуются для введе-

ния гена в бактериальные клетки, основан на применении бакте-

риофагов в качестве вектора. Ген, теми же методами, что и в плаз-

миду, встраивают в бактериофаг. Чаще всего для этих целей исполь-

зуются фаги , М13 и Х174. После этого культуру клеток Escheri-

chia coli заражают фагом. Фаг проникает в клетку, используя соот-

ветствующие рецепторы, имеющиеся на поверхности клеточной

мембраны. Вместе с фагом  в клетку проникает и встроенный в ДНК

фага ген эукариотической клетки, который реплицируется вместе с

генами бактериофага при  размножении последнего в клетке. Пре-

имущество использования  бактериофагов вместо плазмид состоит в

том, что в бактериофаг  можно встроить значительно более  длинный

фрагмент чужеродной ДНК, чем в плазмиду. Кроме того, бактерио-

фаги могут встраиваться в бактериальную хромосому и  передавать-

ся всем потомкам данной клетки.

 

 

 

 

 Генная   инженерия   в   клетках   млекопитающих   и   эмбрионах 

Еще до созданания методов  генной   инженерии  гибридизация

соматических  клеток , или слияние двух соматических клеток, по-

зволяла осуществить перенос генов. Если две линии клеток культи-

вировать вместе в присутствии полиэтиленгликоля или вируса Сен-

дай, слияние клеток двух линий приведет к слиянию ядер, которые

содержат хромосомы родительских клеток  и  проявляют характер-

ные для них признаки. Такие гибридные клетки можно отобрать в

селективной среде. В ходе размножения гибридная клетка может

терять хромосомы одной  или обеих родительских клеток, может  так

же начаться экспрессия гена, молчащего на протяжении нескольких

поколений. Иногда ген, который  в родительской линии клеток

обычно не проявляется, начинает работать в гибридной клетке.

Например гены - и - цепей гемоглобина, которые не активны в

фибробластах начинают функционировать, если фибробласт слива-

ется с эритроцитом. По-видимому, регуляторный фактор эритроцита

активирует гены глобина  в хромосоме фибробласта.

Введение новых генов  в клетки эукариот может быть достиг-

нуто посредством заражения этих клеток вирусом , например виру-

сом обезьян SV 40, в ДНК  которого встроен нужный ген. Вирионы

SV 40 представляют собой  сферические частицы. Они содержат  три