Клинлабдиагностика

 

 

СПЕКТРОФОТОМЕТРЫ

Спектрофотометрия применяется не только для количественных измерений, но и для задач качественного анализа. Во многих случаях для аналитических целей необходимо установить точное положение максимумов и минимумов в спектре поглощения. В спектрофотометре нужные участки спектра выделяются при помощи поворота специальных стеклянных призм, кварцевых призм, вогнутых зеркал или дифракционных решеток, поэтому можно устанавливать любую длину волны в заданном диапазоне. Многие спектрофотометры оснащены графической регистрацией. В этих случаях предусмотрено плавное автоматическое изменение длины волны. Как правило, такие приборы позволяют полностью автоматически регистрировать спектры поглощения либо на диаграммной ленте, либо на экране монитора компьютера.

Обычно такие приборы либо двух лучевые, либо используют возможности компьютера для введения компенсации на неравномерность поглощения растворителя, находящегося в кювете сравнения. При ручной смене длины волны автоматическая регистрация спектра невозможна, поэтому компенсация на изменение поглощения растворителя при смене длины волны производится также вручную с помощью специальных органов управления. Такие приборы, как правило, однолучевые, а стоимость их намного ниже, чем двулучевых с автоматической регистрацией спектра.

При «ручной» регистрации спектра или измерении оптической плотности на какой-либо одной длине волны последовательность операций измерения на спектрофотометре не отличается от таковой для колориметра. По кювете сравнения (с чистым растворителем) устанавливают 100 % пропускания шкалы путем изменения чувствительности фотодетектирующей части либо меняя ширину светопропускающей щели. Затем под луч устанавливают кювету с контролируемым образцом и повторяют измерение. Для перемещения кюветы приборы, как правило, оборудуют специальным приспособлением (кареткой).

Важная особенность работы на спектрофотометрах по сравнению с колориметрами - необходимость правильного выбора ширины щели. Шириной щели спектрофотометра определяется ширина выделенного щелью интервала длин волн: чем шире щель, тем шире и спектральный интервал. При слишком широкой щели возможны ошибки за счет прохождения света с длинами волн, соседними с выбранной. В паспорте прибора обычно указаны не только геометрическая ширина щели, но и значения зависимости спектральной ширины щели от геометрической ее ширины при разных длинах волн. В идеальном случае ширина щели не должна превышать 2 нм. Однако это может потребовать слишком узких щелей, при которых интенсивности света может недоставать даже для кюветы сравнения. Также при спектрофотометрии значительные ошибки может вносить мутность объекта вследствие светорассеяния.

На отечественном рынке представлено очень много импортных спектрофотометров, поставляемых, как правило, совместно с компьютером и соответствующим программным обеспечением и пригодных для работы в различных областях спектра. Например, такие, как спектрофотометры фирмы Shimadzu (UV-3101 РС, UV-1601), обладающие очень большими возможностями и очень дорогие. Из отечественных наиболее подходят для задач лабораторного клинического анализа следующие спектрофотометры:

СФ- 101, работающий в диапазоне 200-1000 нм, с фиксированной шириной щели 5 нм, со встроенным двухстрочным дисплеем;

СФ- 103 - однолучевой сканирующий спектрофотометр, работающий в диапазоне 190-1100 нм, со встроенным графическим дисплеем;

СФ-201 однолучевой сканирующий спектрофотометр, работающий в диапазоне 190-1100 нм, со встроенным графическим дисплеем, с фиксированной спектральной шириной щели 1,8 нм, управляемый с клавиатуры (или мыши) компьютера.

Кроме того, можно еще встретить сравнительно недорогие отечественные спектрофотометры СФ-46 и даже СФ-26, обладающие неплохими оптическими характеристиками и простыми в эксплуатации.

 

 

ФЛЮОРИМЕТРЫ (ЛЮМИНОМЕТРЫ)

Принцип работы флюориметров основан на измерении величины люминесценции - интенсивности излучения некоторых веществ вследствие возбуждения под действием света определенной длины волны, причем длина волны возбуждающего света всегда короче длины волны света излучаемого. Поэтому для возбуждения в люминометрах используют различные источники ультрафиолетового излучения, как правило, достаточно мощные.

Свет от источника ультрафиолетового излучения с помощью специальных линз фокусируется на кювете с исследуемым веществом и возбуждает флуоресценцию в растворе, которая с помощью специальных линз фокусируется на фотодетектирующем устройстве. Благодаря работе фотодетектора происходит пропорциональное преобразование светового сигнала в электрический.

В общем случае интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества. Однако данное утверждение справедливо лишь для достаточно малых концентраций. При повышении концентрации флуоресцирующего вещества наблюдается ряд эффектов (реабсорбции и экранирующий), благодаря которым зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации испытывает значительные отклонения от линейности. В аналитических процедурах с использованием флуориметрии, также как в фотометрии, применяют калибровочные графики, построенные на основании флуориметрии эталонных растворов.

Область применения приборов довольно широкая - от биохимических аналитических (витаминов, гормонов, ферментов) до микробиологических (определение концентрации микробных тел, связанных с мечеными флуоресцеином антителами) и иммунологических исследований.

Из представленных на отечественном рынке сравнительно недорогих отечественных флуориметров для лабораторных клинических исследований наиболее пригоден анализатор «Флюорат-02» НПП «ДОЗА» модификаций 02-01 и 02-03, работающий в спектральном диапазоне 200-600 нм. Его рабочие области задаются светофильтрами, позволяющими проводить не только флуоресцентный анализ, но и фотометрический, хемилюминесцентный и анализ фосфоресценции.

 

 

ПЛАМЕННЫЕ ФОТОМЕТРЫ

Применяются при количественном элементном анализе.

Принцип работы пламенных фотометров основан на изучении окраски пламени при внесении в пламя горелки исследуемого вещества в виде аэрозоля. Изменение окраски, обусловлено излучением, сопровождающим переход атомов распыленного в пламени вещества из более высокого энергетического состояния в более низкое. Молекулы солей металлов, попадая в пламя, вследствие высокой температуры распадаются на отдельные ионы, электроны которых непрерывно переходят из одного энергетического состояния в другое, что сопровождается непрерывным излучением и поглощением света.

Минимальная температура, необходимая для атомизации и возбуждения, зависит от природы исследуемого элемента, но довольно мало от состава соединения, в который этот элемент входит. Поэтому возможности метода пламенной фотометрии ограничиваются возможностями создания пламени высокой температуры.

При сгорании бытового газа (метан) в воздухе метод позволяет определять содержание лишь легковозбудимых щелочных металлов - лития, калия, натрия. При переходе к высокотемпературному пламени, такому, как водород в кислороде или ацетилен в кислороде, возможности метода значительно расширяются.

Современные приборы для пламенной фотометрии оснащены устройствами дозирования и введения исследуемых растворов в пламя горелки; оптической системой, формирующей луч света, падающий в приемник; электронными усилителями сигнала; блоками индикации или регистрации сигнала; устройствами поджига горелки и др. В некоторых приборах фотоэлектрический сигнал формируется совокупностью устройств таким образом, что его величина становится пропорциональной концентрации исследуемого вещества, а шкала прибора градуирована в единицах концентрации исследуемого вещества.

 

Наиболее часто в клинических лабораториях пламенную фотометрию используют для определения содержания калия и натрия, тем более что обычные химические методы определения этих элементов сложны и неточны.

На российском рынке на сегодняшний день представлено значительное количество пламенных фотометров различных фирм. Наиболее оптимален для работы диагностической клинической лаборатории отечественный ФПА-02, поставляемый с компрессором.

 

 

АТОМНО-АБСОРБЦИОННЫЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРЫ

Атомная абсорбциометрия используется для количественного определения содержания металлов в растворах. Принцип работы атомных абсорбциометров основан на поглощении ультрафиолетового или видимого излучения атомами газа. Для перевода образца растворенного вещества в газообразное состояние раствор впрыскивают в пламя. В качестве источника излучения применяют лампу с полым катодом из того же металла, что и определяется в данный момент.

Спектральная ширина линии, испускаемой источником света, как и линии поглощения того же самого элемента в пламени, порядка 0,001 нм, поэтому мешающее поглощение других присутствующих элементов практически исключено.

Температура пламени, как и в случае пламенной фотометрии, определяется горючей газовой смесью. При определении элементов, образующих трудно диссоциирующие соединения (алюминий, бериллий, кремний, ванадий, молибден), используют высокотемпературное пламя (ацетилен - оксид азота). Для клинической лаборатории в большинстве случаев достаточно воздушно-пропанового пламени.

Фотометры для атомной абсорбции - высокочувствительные приборы, но для каждого определяемого элемента должна быть своя лампа, что конструктивно усложняет прибор.

Как и в пламенном фотометре, в атомно-абсорбционном - для распыления используют различные эжекторы. Интенсивность распыления зависит от условий их работы, на что, в свою очередь, влияет вязкость раствора. Поэтому при работе с вязкими, богатыми белком жидкостями, такими, как сыворотка крови, разведение должно быть всегда одним и тем же.

Преимущество атомной абсорбциометрии перед традиционными методами анализа проявляется в полной мере в клинической лаборатории при определении таких микроэлементов, как медь, марганец, цинк, а также при токсикологических исследованиях при определении содержания ртути.

Из представленных на рынке атомно-абсорбционных спектрофотометров можно выделить отечественный «Квант-2А» с пламенной атомизацией и его модификации, отличающиеся комплектацией и другими способами атомизации образца, а также «Аналитик-2000» и «Спираль-17». Однако все приборы весьма дорогие.

 

 

ПОЛЯРИМЕТРЫ

Приборы этой группы применяются для поляриметрическоro анализа, основанного на измерении угла вращения плоскости поляризации луча света, прошедшего через оптически активную среду.

Многие вещества способны изменять плоскость поляризации поляризованного света, причем угол изменения плоскости поляризации бывает пропорционален концентрации этого вещества.

Поляриметры имеют источник света - поляризатор - прозрачную кристаллическую пластинку, пропускающую свет, поляризованный в определенной плоскости; устройство для кювет с анализируемым веществом и анализатор - вторую пластинку, пропускающую поляризованный свет, вращая которую можно измерить угол смещения поляризации в луче света, прошедшем через раствор, по отношению к плоскости исходного луча.

Таким образом, свет проходит через светофильтр, пропускающий только узкий диапазон длин волн, конденсор, формирующий луч, поляризатор, кварцевую пластинку, кювету с анализируемым веществом, анализатор, объектив и окуляр и попадает в глаз исследователя. Вращением регулирующего устройства выравнивается освещенность двух (или иногда трех) полей, наблюдаемых исследователем в объективе. Регулирующее устройство имеет градуировку, по которой определяется угол смещения поляризации и в конечном итоге концентрация вещества.

При вращении анализатора в поляриметрах П-161М и П-161СМ и две наружные части поля освещаются или затемняются в зависимости от угла поворота, а средняя часть поля меняет освещенность в обратном порядке. Показания с оптической шкалы регистрируют при положении, когда средняя часть поля затемняется одинаково с крайними, а границы полей исчезают. Определение правовращающих веществ на СМ проводится на шкале 0-35°, а лево вращающих - от 360 до 325°, при этом угол вращения определяется как разница между 360° и величиной отсчета по шкале.

В автоматических поляриметрах «Р 3002 KRUSS» или «Polartronic N Н8» никакого вращения анализатора не требуется, все результаты сразу высвечиваются на шкале дисплея, но стоимость этих приборов в 10 раз выше.

Особое место занимают специализированные поляриметры сахариметры, специально предназначенные для определения содержания сахаров в различных жидкостях. В лабораторной клинической практике широко применяется для анализа глюкозы в моче поляриметр МР-1010, используемый и для выявления фальсификации меда сахаром при ветеринарно-санитарной экспертизе. Чаще всего с этой целью пользуются поляриметрами П-161М и СУ-5.

 

 

РЕФРАКТОМЕТРЫ

Рефрактометры предназначены для определения показателя преломления вещества. В наиболее распространенных среди них (за основу конструкции взяты рефрактометры Аббе и Пульфриха) луч света от зеркала попадает на призму из двух половинок, между которыми помещают слой исследуемого вещества (несколько капель).

Поле в окуляре рефрактометра при этом выглядит равномерно освещенным. Поворотом призмы достигается полное внутреннее отражение света от поверхности раздела между нижней половиной призмы и анализируемым веществом, что наблюдается в окуляре появлением темного поля с резко очерченными границами. После этого перекресток нитей в окуляре специальным микрометрическим винтом наводят на границу темного поля, делают отсчет значения п по шкале прибора. В зависимости от типа рефрактометра точность измерения показателя преломления может достигать от 0,0001 до 0,00001.