Вирусология

Возбудитель инфекционного  ларинготрахеита вызывает контагиозное заболевание.

2. Патогенез.  Выражен тропизм к эпителиальным тканям дыхательных путей, в которых вирус репродуктируется, вызывая воспалительный процесс. В просвете трахеи скапливается слизистый экссудат с примесью крови и фибрина. Из эпителиальных тканей вирус кровотоком разносится в другие органы, в которых изменения, как правило, не возникают. Виремия непродолжительная. Вирус длительное время персистирует в слизистой оболочке трахеи и гортани.

3. Клинические признаки. Инкубационный период составляет 2…30 суток. Клинические признаки отличаются разнообразием. Ларинготрахеальная форма проявляется остро и характеризуется угнетением, вялостью, отсутствием аппетита, малоподвижностью. Дыхание затруднено, клюв открыт; слезотечение и истечение из носовых отверстий. Птица откашливает  экссудат, иногда с примесью крови. Смертность достигает 60%. При конъюнктивальной форме основные клинические признаки – гиперемия слизистых оболочек глаза, деформация глазной щели, отечность век, светобоязнь и слезотечение.

4. Патологоанатомические  изменения. В просвете гортани плотные казеозные наложения, в дыхательных путях – слизисто-геморрагический сгусток, заполняющий просвет трахеи и крупных бронхов. Паренхиматозные органы застойно-гиперемированы, сердце увеличено, слизистая оболочка кишечника и клоаки воспалена.

5. Эпизоотологические  особенности. К вирусу восприимчивы куры, фазаны, индейки. Источник возбудителя – больные и переболевшие птицы. Заражение происходит аэрогенно. Резервуаром могут быть кровососущие насекомые  и членистоногие. Болезнь протекает в виде эпизоотий.

6. Диагноз. Ставят на основании эпизоотологических и клинических данных, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований.

Патологический материал: прижизненно – кровь, экссудат из трахеи; от трупов – слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы носовых проходов и кусочки легких.

Схема лабораторной диагностики. I. Экспресс-методы: РИФ, РГА, обнаружение телец включений. II. Вирусологические исследования: 1) выделение вируса из культуры клеток почек эмбриона и цыплят, на куриных эмбрионах и цыплятах; 2) идентификация выделенного вируса в РН, РДП, ИФА. III. Ретроспективная диагностика: РН, РДП, ИФА.

Дифференциальный диагноз. Необходимо исключить болезнь Ньюкасла, оспу, заразный насморк, хронический пастереллез, респираторный микоплазмоз.

Срок исследования –  до 7 суток.

7. Иммунитет. Переболевшие птицы приобретают пожизненный иммунитет.

8. Лечение. Не разработано.

9. Специфическая профилактика. Применяют сухую вакцину. Иммунизацию проводят путем втирания вакцины стеклянным шпателем в слизистую оболочку верхнего свода клоаки.

 

 

Вопрос №3. Иммуноферментный метод диагностики вирусных болезней животных.

Материальное обеспечение: набор для серологической диагностики вирусной инфекции иммунным методом; сыворотка крови иммунизированных животных (отрицательный контроль), сыворотка крови иммунизированных животных (положительный контроль и испытуемая сыворотка); дистиллированная вода; многоканальные пипетки, градуированные пипетки на 1…10 мл, резиновые груши, мерные цилиндры, колбы, фотометр.

Методические указания. Иммуноферментный метод основан на взаимодействии антигена и антител, где в качестве метки конъюгате (комплекс антитела или антигена с ферментом) используется фермент проксидаза или другие и соответствующая им субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и перекись водорода или ортофенилендиамин и перекись водорода). По чувствительности этот метод в 100 раз и более превышает РНГА, РДП и др. Предел чувствительности иммуноферментного метода достигает 10 нг/мл специфического белка.

Иммуноферментный метод  в вирусологии используется для  выявления и идентификации вируса и антител к нему.

Различают две разновидности  иммуноферментного метода: гомогенный и гетерогенный. Гетерогенный метод в литературе описан под названием иммуносорбентного – ELIS-теста и РЭМА – реакция энзиммеченых антител (или антигенов), адсорбированных на поверхности водонерастворимых полимерных материалов. При моногенном иммуноферментном методе не используется твердая фаза. Гомогенный иммуноферментный метод в основном предназначен для определения низкомолекулярных антигенов (гормонов, лекарственных препаратов).

Для выполнения твердофазного  иммуноферментного метода необходимы определенные компоненты.

1. Специфические иммуноглобулины (выделяю из гипериммунной сыворотки осаждаемым сульфатом аммония с последующей очисткой).
2. Антивидовые глобулины (выделяют из антивидовых   сывороток осаждаемым сульфатом аммония с последующей очисткой).
3. Белок А (выделяют из золотистого стафилококка) или бычий сывороточный альбумин.
4. Антиген (готовят из органов зараженных животных). Заведомо положительные и отрицательные антигены.
5. Фермент пероксидаза (выделяют из хрена).
6. Конъюгаты (пероксидаза, связанная с антителами или антигеном методом периодатного окисления).
7. Субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и пероксид водорода или ортофенилендиамин и пероксид водорода).
8. Детергент (поверхностно активные вещества: твин-20, -80, тритон х-100, сорбиталь с-20).
9. Иммунологический планшет (планшет из прозрачного полистирола).
10. Шприц-дозатор (для разливания ингредиентов реакции). На биофабриках и лабораториях научно-исследовательских институтов  готовят диагностические наборы.

Существуют прямой и  непрямой методы постановки этой реакции. На практике в основном используют непрямой метод.

Иммуноферментный метод  определения антигена. Перед постановкой реакции лиофинизированные компоненты растворяют в объеме, указанном на этикетке, 0,01 М раствором фосфатного буфера или дистиллированной воды и доводят до объема рабочих разведений. Объем компонентов, вносимых поэтапно в лунки планшета составляет 0,1 мл.

Этапы постановки реакции.

1. Сенсибилизация планшета. В лунки планшета вносят специфические антитела (иммуноглобулины) а рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с антителами инкубируют в термостате при 37 ̊С в течение 3 часов или при 4 ̊С в течение 18 часов. По окончании инкубации проводят обмывку планшета раствором фосфатного буфера, содержащим твин, 3…4 раза предварительно встряхнув содержимое лунок. Остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.
2. Внесение агентов. В лунку планшета, сенсибилизированные специфические антителами, вносят контрольные положительные и отрицательные антигены и исследуемую пробу в разведении от 1:10 до 1:1280, инкубируют в термостате при 37 ̊С в течение 1 часа. По истечении срока инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от несвязавшихся с антителом антигенов и подсушивают на фильтровальной бумаге (рис. 2, 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.2. Схема определения антигена методом двойных антител («сандвич») в твердофазном ИФА: 1 – адсорбция а лунках специфических антител; 2 – внесение исследуемого раствора, который соединяется с антителами; 3 – добавление ферментомеченых специфических анител4; 4 – внесение субстрата и появление цветного продукта ферментной реакции; Е – субстрат.

Рис.3. Схема определения антитела непрямым методом твердофазного МФА: 1 - адсорбция а лунках специфических антител; 2 – внесение исследуемого раствора. Специфические антитела фиксируются на антигене; 3 – внесение ферментомеченого активного глобулина, фиксирующегося на антителах; 4 – внесение субстрата и появление цветного продукта ферментной реакции; Е – субстрат.

 

3. Внесение пероксидазного активного конъюгата в рабочем разведении с целью выявления комплекса «антиген + антитело». Залитые планшеты помещают в термостат при 37 ̊С на 1 час. Затем лунки планшета трехкратно отмывают физиологическим раствором и подсушивают.
4. Внесение субстратной смеси. Для проявления реакции в лунки планшета вносят раствор субстрата (индикатора пероксидазы) – ортофенилдиамина, к раствору которого добавляют 3%-й раствор перекиси водорода для выявления комплекса «антиген + антитело + конъюгат». Планшеты закрывают и оставляют в темном месте при комнатной температуре на 15…30 минут.
5. Учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически. При визуальной оценке учет реакции проводят по 4-плюсовой системе:

++++ - интенсивное оранжевое  окрашивание;

+++ - оранжевое окрашивание;

++ - бледно-оранжевое окрашивание;

+ - желтое окрашивание.

Пробу считают положительной  при оценке в два креста (+ +) и  более. За титр антигена принимают то ее наивысшее разведение, при котором  в реакции со специфическим антителом  наблюдается бледно-оранжевое окрашивание (+ +), значительно превосходящее по интенсивности окрашивание контрольных лунок планшета.

При спектрофотометрическом учете результатов реакции проводят расчет коэффициента специфичности, который равен оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным агентом (ОП¹) к оптической плотности субстратной смесив лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП²). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1 и отрицательной, если не ниже 2,1.

Постановка иммуноферментного  метода для обнаружения (или титрования) антитела такая же, как и при обнаружении и идентификации вируса антигена, но с той разницей, что материалом служит исследуемая сыворотка крови.

 

Список используемой литературы

1. Госманов Р. Г. Ветеринарная вирусология / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев – М.: КолосС, 2006. – 304 с.
2. Госманов Р. Г. Ветеринарная вирусология / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев – Омск: ОмГАУ, 1999. – 288 с.