Программируемая клеточная смерть

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 07 Июля 2013 в 16:22, реферат

Краткое описание

Кратко рассмотрены сведения о программируемой клеточной смерти (апоптозе) у животных и растений. Патологический вариант клеточной гибели некроз, сопровождаемый у животных воспалительным процессом. В результате апоптоза клетки животных и растений дробятся на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым. Эти везикулы у животных поглощаются соседними или специализированными клетками (фагоцитами). У растений нет таких специализированных клеток, фагоцитозу препятствуетналичие клеточной стенки. Рассмотрены основные молекулярные механизмы апоптоза у животных, пути активации каспаз эволюционно-консервативных цистеиновых протеаз.

Вложенные файлы: 1 файл

Программируемая клеточная смерть-иммунология.doc

— 176.00 Кб (Скачать файл)

Программируемая клеточная смерть.

 
Кратко рассмотрены сведения о  программируемой клеточной смерти (апоптозе) у животных и растений. Патологический вариант клеточной  гибели некроз, сопровождаемый у животных воспалительным процессом. В результате апоптоза клетки животных и растений дробятся на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым. Эти везикулы у животных поглощаются соседними или специализированными клетками (фагоцитами). У растений нет таких специализированных клеток, фагоцитозу препятствуетналичие клеточной стенки. Рассмотрены основные молекулярные механизмы апоптоза у животных, пути активации каспаз эволюционно-консервативных цистеиновых протеаз. В особый раздел выделены процессы программируемой клеточной смерти у микроорганизмов: 1)гибель клеток слизистого гриба Dictyostelium discoideum и паразитического жгутиконосца Trypanosoma cruzi; 2)программируемая гибель генноинженерных штаммов дрожжей, экспрессирущих проапоптозные белки Bax и Bak; 3)гибель части клеточной популяции прокариот при исчерпании питательного субстрата или под влиянием стресс-факторов; 4)элиминация клеток Escherichia coli, лишившихся плазмидных систем, кодирующих стабильный цитотоксический агент в сочетании с лабильным противоядием к нему; 5) программируемая гибель бактериальных клеток, зараженных фагом. Обсуждается взаимосвязь программируемой смерти и некультивируемого состояния у микроорганизмов.  
This paper briefly overviews the data on programmed cell death (apoptosis) in animals and plants. Necrosis represents a pathological scenario of cell death, which is accompanied by inflammation in animals. Apoptosis results in disintegration of animal and plant cells into membrane vesicles enclosing the intracellular content, which are thereupon absorbed by adjacent cells or specialized cells (phagocytes). Plants lack such specialized cells, and plant cell walls prevent phagocytosis. The paper considers the main molecular mechanisms of apoptosis in animals and the pathways of activation of caspases, highly conserved cysteine proteases. A special section concerns itself with the process of programmed cell death (PCD) in microorganisms including (i) cell death in the myxomycete Dictyostelium discoideum and the parasirtic flagellate Trypanosoma cruzi; (ii) PCD in genetically manipulated yeasts expressing the proapoptotic proteins Bax and Bak; (iii) death of part of a prokaryotic cell population upon depletion of nutrient resources or under stress; (iv) elimination of cells after a loss of plasmids encoding a stable cytotoxic agent in combination with a labile antidote; (v) PCD in phage-infected bacterial cells.  
У многоклеточных организмов животных, растений и грибов генетически заложена программа гибели клеток. Формообразовательные процессы в онтогенезе, позитивная и негативная селекция Т- и В-лимфоцитов у животных, гиперчувствительный ответ растений на вторжение патогена, осенний листопад лишь несколько примеров программируемой клеточной смерти (ПКС). ПКС способствует сохранению порядка и нормального функционирования биологической системы, очищая от невостребованных, больных, закончивших свой жизненный цикл или появившихся врезультате мутаций потенциально опасных клеток. Количество научных работ в этой области нарастает по экспоненте. Цель настоящей работы кратко рассмотреть сведения об апоптозе у животных и растений и затем, базируясь на этих данных, ответить на вопрос, существует ли программируемая гибель клеток у микроорганизмов.  
Апоптоз и некроз два варианта клеточной смерти  
Клеточная смерть известна с момента открытия самой клетки, еще с 1665 г.: Р. Гук (R. Hooke) (см. [1]) описал формации коры дуба из погибших клеток. Однако долгое время это наблюдение оставалось без внимания. Первые гистологические описания клеточной смерти опубликовали К.Фогт (C.Vogt) в 1842 г. (см. [2]) и Р. Вирхов (R.Virchow) в 1859 г. (см. [3]). В формировании современных представлений о ПКСважное место занимает работа Kerr et al. [4] о существовании двух различных видов клеточной смерти у животных апоптоза и некроза.  
Вот пример апоптоза из области иммунологии. Вирусы, некоторые бактерии, грибы и простейшие являются внутриклеточными паразитами. Хотя специфичные к ним антитела вырабатываются организмом человека или животного, они не могут настигнуть вредителя, затаившегося в цитоплазме, под покровом клеточной стенки жертвы. И тогда в ход вступают цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры). Они убивают клетки, ставшие жертвами инфекционного возбудителя, и тем самым прекращают его дальнейшее размножение. Обладая аппаратом распознавания зараженной клетки (клетки-мишени) среди массы здоровых клеток, Т-киллер вызывает ее гибель, включая программу самоубийства клетки-мишени генетически запрограммированную клеточную смерть, или апоптоз.  
Картина апоптоза у животных это переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, уменьшение объема клетки, сморщивание цитоплазматической 
мембраны, конденсация ядра, разрывы нити ядерной ДНК и последующий распад ядра на части, фрагментация клетки на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым (апоптозные тельца), фагоцитирующиеся макрофагами и клетками-соседями. Такая же участь постигает клетку, когда в ней произошла мутация, которая может привести к опухолевому разрастанию ткани, когда она становится ненужной для организма, например, в процессе онтогенетического развития или, применительно к лимфоцитам, на заключительных этапах инфекционного процесса, когда организм уже не нуждается в дальнейшей выработке антител [57].  
Есть и другая, патологическая, форма клеточной смерти некроз. Такая смерть постигает клетку, когда Т-киллер своевременно не распорядился судьбой инфицированной клетки, наставив ее на путь апоптоза. Вирус или иной паразит, размножившись в клетке, разрушает ее: клетка лизируется, ее содержимое изливается наружу, в межклеточное пространство. Некоторые внутриклеточные паразиты, включая простейшее Toxoplasma gondii (возбудитель токсоплазмоза), способны к подавлению апоптоза [8]. Новое поколение паразитов устремляется в соседние клетки, нанося все больший и больший ущерб организму. Начинается воспалительный процесс, исходом которого может быть как выздоровление, так и гибель организма. Некротическую гибель могут вызывать физические или химические повреждения, например, обморожение или ожог, органические растворители, гипоксия, отравление, гипотонический шок и др. [5, 7]. Воспаление зачастую это катастрофа для окружающих клеток в организме животного.  
Симптомы воспаления сформулированы еще А.К.Цельсом (A.C.Celsus) это "rubor, calor, tumor et dolor" (покраснение, жар, опухание и боль) [9]. Все это в конечном итоге может привести к нарушению функции (functio laesae) и даже к гибели организма. Галанкин и Токмаков [9] сравнивают воспаление с военными действиями на уровне государств: "В мирное время государство… (многоточие в цитате означает пропуск слов оригинального текста) живет в условиях сбалансированной экономики… Его военный потенциал достаточен для выполнения доктрины разумного сдерживания потенциального противника… Но вот… возникает военный конфликт. Цель освобождения территории от неприятеля достигается … не без потерь: экономика перестраивается…, взрываются коммуникации и трубопроводы, разрушаются жилища и мосты, рвутся линии электропередач, при отступлении применяется тактика выжженной земли… Предположим, армия наступает. Далеко не каждая пуля, выпущенная бегущей пехотой, точно попадает в цель, в спешке моторизованные части могут перевернуть понтон, оглушенный телефонист может неправильно понять приказ, авиация выбросить бомбу на собственную автоколонну и т.д.". Элементы разрушительного характера являются атрибутами воспалительной реакции. Наличиеили отсутствие воспаления у животных используется как признак, позволяющий отличить апоптоз от некроза.  
Некроз характеризуется разрывом цитоплазматической и внутриклеточных мембран, что приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство (рис. 1). При апоптозе сохраняется целостность мембран, органеллы выглядят морфологически интактными, а продукты дробления клетки, апоптозные тельца (или везикулы) представляют собой отдельные фрагменты, окруженные мембраной (рис. 1).  
Форма клеточной гибели по пути апоптоза или некроза во многом определяется внутриклеточной концентрацией NAD+ и АТР. Снижение уровня NAD+ [11] и АТР [1214] ведет к индукции некроза.  
В нормальном организме ПКС механизм для поддержания гомеостаза. Как гипофункция, так и гиперфункция апоптоза ведут к нарушению гомеостаза.  
Итак, ПКС естественный этап в жизнедеятельности клеток животных. А как дело обстоит у растений? С физиологической клеточной смертью в жизни растений связаны процессы формообразования в онтогенезе, иммунные реакции на внедрение патогена (см. обзоры [1, 1522]).  
Ксилогенез и флоэмогенез. Клетки, которым предстоит стать трахеидами ксилемы, выполняющей водопроводящую и опорную функцию, претерпевают дробление протопласта на везикулы, характерные для апоптоза животных [1, 17, 19, 20]. Развитие ситовидных трубок флоэмы тоже сопровождается дроблением ядра, как при апоптозе. Показано существование генов ted2, ответственных за реализацию процесса сосудообразования [1].  
Формообразование листьев. Очертания листьев у растений, по-видимому, формируются через механизм ПКС. У представителей р. Monstera (сем. Аронниковые), места пеpфораций, наличие лопастей определяется зонами гибели клеток на ранних стадиях развития. Этот процесс также находится под генетическим контролем [1, 17].  
Аэренхимогенез. Это адаптивная реакция растений на дефицит кислорода, например, при затоплении, заключающаяся в образовании полостей, заполненных воздухом, за счет элиминации некоторых клеток с полным разрушением клеточных стенок с участием активирующихся гидролитических ферментов [15, 17].  
Клетки корневого 
чехлика. Эти клетки защищают апикальную меристему корня при прорастании семян [17]. Программа гибели этих клеток включается даже при выращивании растений гидропонным способом.  
Опадание листьев и созревших плодов [1, 17, 22]. Эти процессы сопровождаются избирательной гибелью клеток отделительной зоны, расположенной между основанием черешка листа или плода и стеблем, которая активируется благодаря экспрессии так называемых sag-генов (senescence-associated genes). Клетки в отделительном слое секретируют ферменты, разрушающие клеточные стенки (пектиназы и целлюлазы). Локально действуя на определенный участок, ферменты частично растворяют клеточную стенку в отделительном слое, а сами клетки отделительного слоя подвергаются автолизу, клеточные полимеры распадаются. Одновременно с этим в слое клеток со стороны стебля откладывается водоустойчивый суберин, защищающий оголенный участок ткани, возникающий после отделения листа в результате ферментативного гидролиза полимеров.  
Прорастание пыльцевой трубки. Этот процесс осуществляется в результате гибели клеток на пути прорастающей пыльцевой трубки, зависит от видовой принадлежности пыльцы и не включается при действии чужеродной пыльцы [1].  
Алейроновые клетки. В семенах однодольных растений имеются алейроновые клетки. При прорастании семян эти клетки секретируют ферменты, катализирующие гидролиз запасных полимеров эндосперма и обеспечивающие тем самым питание проростка. Будучи ненужными для последующего развития, алейроновые клетки погибают по завершении прорастания. По ряду признаков их гибель имеет характер ПКС [17]. Ядерная ДНК расщепляется на олигонуклеосомальные фрагменты, процесс стимулируется гиббереловой и блокируется абсцизовой кислотой (см. [17]). В расщеплении ДНК принимают участие нуклеазы, активность которых регулируется гиббереловой и абсцизовой кислотой [23].  
Соматический эмбриогенез [17]. В суспензионных культурах клеток некоторых видов растений индуцируется соматический эмбриогенез: из одиночных клеток можно вырастить взрослые растения свойство тотипотентности растений. Тотипотентные клетки делятся асимметрично на две клетки, одна из которых останавливает синтез ДНК и погибает спризнаками ПКС, тогда как другая, продолжая развиваться, дает проросток.  
Иммунная реакция на патоген [1, 1618, 21, 2426]. Устойчивость растения к патогену определяется способностью распознать и своевременно включить механизм защиты. Наряду с индукцией синтеза фитоалексинов (растительных антибиотиков) и гидролитических ферментов, к таким механизмам относится активация в инфицированных клетках и клетках, локализованных вблизи очага инфекции, программы собственной гибели процесс, называемый гиперчувствительным ответом (ГО). Образуется зона мертвых обезвоженных клеток, которая служит барьером для дальнейшего распространения патогена. ГО ответ растений на патогенные вирусы, бактерии, грибы и нематоды. При этом гибель клеток растений вызвана не прямым деструктивным действием патогена, а активацией патогеном генетической программы гибели растительной клетки. Процесс сопровождается дыхательным взрывом генерацией О2Aпри участии NADPH-оксидазы цитоплазматической мембраны, подобной таковой у макрофагов и нейтрофилов млекопитающих. Кроме NADPH-оксидазы, Н2О2 в клетках растений образуется при участии пероксидаз клеточной стенки [27], оксалатоксидазы [28], а также при окислении NAD+-зависимых субстратов или сукцината комплексами I или II дыхательной цепи митохондрий [29]. ГО на одном или нескольких листьях растения ведет к развитию иммунитета в других листьях, которые не имели контакта с патогеном. Такой иммунитет у растений называют системной приобретенной устойчивостью.  
Изменения в морфологии клеток растений, претерпевающих ПКС, сходны с таковыми при апоптозе у животных [16, 23, 30]. Также наблюдается конденсация и дробление ядра на фрагменты, съеживание протопласта и складчатость цитоплазматической мембраны. Происходит разрыв плазмодесм мембранных мостиков, сообщающих содержимое соседних клеток, по которым происходит распространение инфекции из зараженной клетки в соседние [31]. Сжатие протопласта приводит к отделению его от клеточной стенки. В конечном итоге протопласт дробится на отдельные везикулы, аналогичные апоптозным тельцам.  
Тогда как у животных апоптозные везикулы in vivo поглощаются соседними или специализированными клетками, у растений нет таких специализированных клеток. Более того, фагоцитозу препятствует наличие клеточной стенки. Апоптозные везикулы у растений в дальнейшем разрушаются. Такая деградация может стимулироваться ферментами, секретируемыми соседними клетками. И в конечном итоге останки разрушенных клеток утилизируются другими клетками, что отмечается при отмирании листьев [22]. При отмирании листа клеточные полимеры распадаются, а мономеры вновь используются растением. Однако такой вариант заключительного этапа клеточной гибели невозможен при ГО, поскольку отмершие клетки несут в себе патоген. В этом случае образуются 
так называемые демаркационные, отторгающие, ткани вследствие приобретения здоровыми клетками, расположенными вокруг места поражения, меристематической активности. Возникает перидерма, отгораживающая очаг инфекции. Судьба же клеточной стенки, атрибута растительной клетки, неоднозначна. Существуют два возможных пути ее преобразования, диктуемые привязкой к событию и различающиеся конечным результатом.  
Во-первых, клеточная стенка может упрочняться благодаря сшивке белков, образованию целлюлозных утолщений и лигнификации. Укрепление клеточной стенки затрудняет проникновение патогена в клетку или, напротив, способствует замуровыванию уже проникшего микроба внутри клетки. При формировании жестких сосудов проводящей системы (трахеидов ксилемы и ситовидных элементов флоэмы) на стенках соответствующих клеток образуются утолщения, которые затем укрепляются отложением лигнина.  
Второй путь разрушение клеточной стенки при участии активирующихся гидролитических ферментов. Тотальное разрушение клеточных стенок происходит при аэренхимогенезе [15]. Гидролазы действуют локально и частично растворяют клеточную стенку в отделительном слое при листопаде и при отделении созревших плодов [22].  
У растений, как и у животных, наряду с апоптозом, существует некроз. Так, Н2О2 в малых концентрациях индуктор апоптоза, в высоких концентрациях вызывает быструю гибель клеток, без каких-либо морфологических изменений, характерных для апоптоза [24].  
Итак, наряду с делением, дифференцировкой, клеточная смерть является процессом, способствующим нормальному становлению и функционированию организма, необходимым и благоприятным для организма в целом.  
Молекулярные механизмы апоптоза  
Апоптоз многоэтапный процесс. Первый этап прием сигнала, предвестника гибели в виде информации, поступающей к клетке извне или возникающей в недрах самой клетки. Сигнал воспринимается рецептором и подвергается анализу. Далее через рецепторы или их сочетания полученный сигнал последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и в конечном итоге достигаетядра, где и происходит включение программы клеточного самоубийства путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. Однако существование ПКС в безъядерных системах (цитопластах клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса [32].  
Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты (см. обзоры [3335]). На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства а) каспазы-1 (каспазы 1, 4, 5), б) каспазы-2 (каспаза-2) и в) каспазы-3 (каспазы 3, 610) [36]. Цистеиновые протеазы, по-видимому, участвуют также в ПКС у растений [37]. Однако апоптоз возможен и без участия каспаз: сверхсинтез белков-промоторов апоптоза Bax и Bak индуцирует ПКС в присутствии ингибиторов каспаз [38, 39].  
В результате действия каспаз происходит [3336]:  
активация прокаспаз с образованием каспаз;  
расщепление антиапоптозных белков семейства Bcl-2. Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым ICAD или DFF (DNA fragmentation factor). При апоптозе ингибитор ICAD с участием каспаз 3 или 7 инактивируется [40], и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах 180-200 пар нуклеотидов. Эти фрагменты при электрофоретическом разделении в агарозном геле дают характерную "лесенку ДНК". Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК [2]. Обнаружен ядерный белок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), из которого при комбинированном действии каспазы-3 (протеолиз при Asp 1093) и неидентифицированной протеазы (протеолиз при Ser 987) образуется фрагмент Ser 987 Asp 1093. Этот фрагмент в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК [41, 42];  
гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к конденсации хроматина;  
разрушение белков, участвующих в регуляции цитоскелета;  
инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли(ADP-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(ADP-рибозилирование) белков, связанных с ДНК (см. обзоры [3,11]). Донором ADP-рибозы является NAD+. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. Чрезмерная активация 
ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза.  
Существует несколько путей реализации программы ПКС [2, 34, 4346].  
1. Среди них важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы [34, 4752], специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала ПКС схематически можно изобразить следующим образом: индукторы рецепторы адаптеры каспазы первого эшелона регуляторы каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности ТН-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (TNF tumor necrosis factor). Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин), TRAIL (Apo2L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L.  
Fas член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов (рис. 2). Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).  
Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain домен смерти), DED (death-effector domain домен эффектора смерти), CARD (caspase activation and recruitment domain домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков [45, 46]. Домены DD участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein) и во взаимодействии рецепторов TNFR1 и DR3 (death receptor 3) с адаптером TRADD (TNFR1-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10. Адаптер RAIDD (RIP-associated Ich-1/CED-3 homologous protein with a death domain, RIP receptor interacting protein) связывается с прокаспазой-2 через CARD-домены [ 45, 46, 51].  
Наиболее подробно охарактеризована прокаспаза-8 (FLICE/MACH/Mch5), рекрутируемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Образуются агрегаты FasL Fas FADD прокаспаза-8. Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, названы апоптосомами [43], апоптозными шаперонами [53], или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (DISC death-inducing signaling complex) [49].  
Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 12% активности зрелой каспазы [34, 43, 54]. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга) [34, 43, 54]. В результате от прокаспазы (молекулярная масса 3050 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (~10 кДа) субъединицы (рис. 3). Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо друг от друга. Таким образом прокаспаза-8 активируется и высвобождается в цитоплазму в виде каспазы-8.  
Существуют другие пути активации каспазы-8 с участием рецепторов TNFR1 и DR3 [51]. Однако эти пути, включаемые одним и тем же адаптером TRADD, конкурируют с параллельными путями активации ядерных факторов транскрипции NF-єB (nuclear factor kappa B) и JNK/AP-1 (JNK, Jun-N-концевая киназа, является компонентом митоген-активируемого киназного пути, ведущего к активации фактора транскрипции AP-1), зависимыми от адаптеров RIP и TRAF (TNFR1-associated factor).под контролем этих факторов транскрипции находится синтез белковых регуляторов, которые блокируют TNF- или Apo3L-индуцированную активацию каспазы-8. Предполагаются следующие пути передачи про- и антиапоптозных сигналов [51]:  
На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона (см. обзоры [36, 52, 5558]). К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1

 

 

 

АПОПТОЗ. ПРИРОДА  ФЕНОМЕНА И ЕГО РОЛЬ В ЦЕЛОСТНОМ  ОРГАНИЗМЕ*  
А. А. Ярилин 
ГНЦ - Институт иммунологии Минздрава России, Москва


 

2. Роль апоптоза в  многоклеточном организме

2.1. Апоптоз,  процессы формообразования и  клеточного гомеостаза на уровне  организма

Если массовая гибель клеток многоклеточного организма  по механизму некроза (например, вследствие гипоксии) часто ассоциируется с гибелью всего организма, то гибель клеток по механизму апоптоза рассматривается скорее как условие нормального существования организма. В наиболее общей форме назначение апоптоза (в сочетании с его альтернативой — пролиферацией) состоит в определении размеров и “архитектуры” организма, что проявляется:

  • в поддержании постоянства численности клеток;

в определении формы  организма и его частей;          

  • в обеспечении правильного соотношения численности клеток различных типов;
  • в удалении генетически дефектных клеток.

Эти функции апоптоза реализуются на уровне клеточных  популяций - в процессе дифференцировки  клеток и поддержания постоянства  их численности. Роль апоптоза в популяциях неделящихся клеток минимальна; обычно она сводится к реакции на внешние  воздействия (типа ионизирующей радиации). Напротив, в формирующихся и обновляющихся популяциях клеток апоптозу принадлежит существенная роль фактора, уравновешивающего процессы пролиферации и корригирующего дифференцировку. Из этого следует, что интенсивность апоптоза выше в начальные периоды онтогенеза, в частности во время эмбриогенеза, а во взрослом организме апоптоз продолжает играть *Продолжение, начало в №1, 2003. 

 

большую роль лишь в быстро обновляющихся  тканях.

Назначение апоптоза в клеточных  популяциях можно сформулировать таким образом:

  • поддержание численности клеток в популяции на заданном уровне;
  • определение этого уровня и его изменение под влиянием внешних (по отношению к клетке) сигналов вплоть до полной элиминации данного типа клеток;
  • селекция разновидностей клеток внутри популяции (в том числе элиминация клеток с генетическими дефектами).

Хотя общетеоретические  представления в данной области  не разработаны, накоплено достаточно много фактов, позволяющих иллюстрировать вышесказанное.

Наиболее простой иллюстрацией значимости апоптоза для многоклеточного организма являются данные о роли этого процесса в поддержании постоянной численности клеток нематоды Caenorhabditis elegans, о чем уже упоминалось в связи с генетическим контролем апоптоза. Для этого вида свойствен очень жесткий контроль общей численности клеток. Показано, что этот гомеостаз обеспечивается путем апоптоза части клеток. Его индукция и осуществление контролируются набором из 14 генов, из которых один (ces-1) обусловливает выбор апоптического пути, два (ced-З и ced-4) — его реализацию, а остальные или ингибируют апоптоз, или отвечают за фагоцитоз и расщепление погибших клеток.

Примером проявления апоптоза в  поддержании численности отдельных  клеточных популяций может служить  увеличение численности эндотелиальных клеток и размера сосудов у мышей с прицельной инактивацией (“нокаутом”) гена Braf, контролирующего апоптоз эндотелиальных клеток у мышей. In vitro регуляция численности клеток в популяции проявляется в индукции их апоптоза при достижении определенного уровня плотности.

Роль апоптоза в формообразовании иллюстрируют результаты исследования локализации апоптотических клеток в процессе морфогенеза внутреннего  уха у куриных эмбрионов. Апоптозу подвергаются клетки тех участков закладки внутреннего уха, которым предстоит участвовать в формировании полуциркулярных каналов. Подавление апоптоза путем гиперэкспрессии гена bcl-2 обусловливает задержку или отсутствие формирования просвета названных каналов. Морфогенетические аномалии, связанные с блокадой апоптоза, могут быть вызваны также ингибированием биохимических процессов, лежащих в основе апоптоза. Так, ингибиторы каспаз задерживают закрытие нейральной трубки у куриных эмбрионов.

Роль апоптоза в дифференциации отдельных частей органов и их формообразовании изучается на примере становления в эмбриогенезе органов, особенно почки и головного мозга. Особенно пристальное внимание привлекает в этом контексте процесс формирования коры головного мозга. Так, у человеческого плода критическим периодом кортикогенеза является срок с 12-й до 23-й недели беременности, когда происходит интенсивная пролиферация клеток вентрикулярной зоны и миграция нейронов. Наиболее интенсивный апоптоз регистрируется в постмитотических клетках вентрикулярной зоны и вдоль путей миграции нейронов в промежуточной зоне; он отсутствует в кортикальной пластинке. Роль апоптоза при этом сводится к селекции клеток, которым предстоит участвовать в формировании коры. Другим примером селективного апоптоза определенного типа клеток может служить массовая гибель (апоптоз) интернейронов (но не мотонейронов) серого вещества спинного мозга крыс вскоре после рождения.

Формированием условий, способствующих массовому апоптозу целых клеточных  популяций, объясняют такие драматические  события эмбриогенеза, как утрата хвоста зародышами амфибий или атрофия у них гипохорды. В качестве причины внезапной утраты гемопоэтической функции печенью эмбрионов называют тотальный апоптоз кроветворных клеток, вследствие снижения восстановительного потенциала в их микроокружении. Это снижение обусловлено деятельностью гепатоцитов, которая приводит к ослаблению активности g -глутаматтрансферазы и уменьшению концентрации глутатиона.

Наконец, быстрая атрофия гормонально-зависимых  тканей обусловлена апоптозом клеток в связи со снижением концентрации соответствующих гормонов. Процессы такого рода периодически совершаются в женских половых органах в течение менструального цикла. Аналогичные процессы в предстательной железе происходят при снижении концентрации андрогенов. Роль апоптоза в гомеостазе обновляющихся популяций клеток во взрослом организме прослежена также на примере кроветворных клеток, клеток сперматогенного эпителия, энтероцитов ворсинок слизистой тонкой кишки. Во всех этих клеточных популяциях апоптозу подвергаются клетки на определенных стадиях развития. Чувствительность клеток к апоптозу чаще всего определяется ослаблением экспрессии эндогенных ингибиторов апоптоза - Bcl-2, Bcl-xL и др. Так, в сперматогенном эпителии эти факторы экспрессируются слабее всего в мейотических и постмейотических клетках и сильно - в сперматогониях - в полном соответствии с подверженностью апоптозу первых и устойчивостью к нему вторых.

Судьба кроветворных клеток наглядно иллюстрирует зависимость развития их апоптоза от соотношения факторов с противоположным эффектом. Ранние кроветворные предшественники, несущие маркер CD34, не экспрессируют Fas-рецептор; половина этих клеток содержит Всl-2. Под влиянием фактора некроза опухоли или интерферона g Fas-рецептор индуцируется, а экспрессия Вс1-2 ослабляется, и клетки становятся более подверженными апоптозу. Дальнейшая их судьба определяется соотношением цитокинов, препятствующих развитию апоптоза (трансформирующего фактора роста b , ФНО, хемокина MIP-1) или защищающих от него (ИЛ-3 и фактора стволовых клеток для наиболее юных кроветворных клеток, ГМ-, Г- и М-колониестимулирующих факторов и ИЛ-10 для клеток миелоидного ряда, ИЛ-7 для клеток лимфоидного ряда, эритропоэтина для эритроидных клеток, ИЛ-5 для эозинофилов).

Еще более важным для  предотвращения апоптоза развивающихся клеток, в частности кроветворных, является сохранение контакта с межклеточным матриксом, обусловленное мембранными интегринами. Межклеточные контакты могут как способствовать, так и препятствовать развитию апоптоза. Уже упоминалось о контактной индукции апоптоза в плотных культурах клеток. Примерами апоптогенного действия межклеточных взаимодействий могут служить индукция апоптоза пре-В-клеток под влиянием плазмоцитов in vitro. Роль утраты контактов с межклеточным матриксом является универсальной причиной апоптоза клеток, “теряющих свой дом”. Апоптоз неизбежно развивается при отделении клеток от субстрата (при утрате способности или возможности прикрепляться к поверхностям и переходе прилипающих клеток в суспензию). Приобретение устойчивости к такого рода переходам может быть связано с генетическими перестройками и обычно означает малигнизацию клеток.

То же справедливо  в отношении потребности клеток в факторах, защищающих их от апоптоза. Помимо упомянутых цитокинов, поддерживающих выживаемость кроветворных клеток, аналогичные  факторы существуют для всех прочих типов клеток. Примерами таких факторов могут служить фактор роста фибробластов, поддерживающий жизнеспособность фибробластов, коллаген типа II, необходимый для выживания хондроцитов, фактор роста нервов и нейротрофины, защищающие от апоптоза нейроны, и т. д.

Целую систему факторов, контролирующих развитие апоптоза клеток различных типов, образуют морфогенетические белки из костной ткани. Они действуют главным образом на клетки, происходящие из мезодермы, вызывая (реже ингибируя) развитие апоптоза. Спектр этих факторов, обладающих определенной специфичностью в отношении клеток разных типов, неодинаков в различных органах, что в определенной степени определяет судьбу образующих их клеток. Эти факторы участвуют в формировании архитектуры определенных участков тела, например, суставных полостей, в которых локализуются два типа белков этой группы - ВМР-2 и ВМР-7, причем первый содержится на хрящевых поверхностях, формирующих сустав, а второй — в околохрящевой зоне.

Приведенные примеры  лишь выборочно отражают участие  апоптоза в детерминации размеров и формы тела, а также в процессах морфогенеза и поддержания гомеостаза клеточных популяций. Факты такого рода быстро накапливаются, и в ближайшее время можно ожидать новых обобщений в этой области. Пока же они продолжают оставаться в значительной степени разрозненными. Есть лишь одна область знаний, в которой роль апоптоза определялась достаточно точно и разносторонне - это иммунология. К краткому обзору места апоптоза в иммунологических процессах мы обратимся в следующей главе.

2.2. Роль апоптоза в иммунных процессах

Можно выделить 3 стадии развития лимфоцитов, на которых роль апоптоза велика, но реализуется по-разному (табл. 4): 1) до формирования антигенраспознающего рецептора; 2) в период формирования рецептора, последующей селекции и созревания лимфоцитов; 3) в период функционирования зрелых лимфоцитов.

В первой стадии лимфоциты  фактически еще не выделяются из общего семейства кроветворных клеток-предшественников. Выше мы уже говорили о том, что  все эти клетки нуждаются в  факторах выживания, предохраняющих их от самопроизвольного развития апоптоза. Это свидетельствует о предсуществовании в этих клетках программы гибели и отсутствии внутренней защиты в виде экспрессии факторов Вс1-2 и Всl-хl. Основным экзогенным фактором выживания предшественников лимфоцитов обоих классов служит ИЛ-7. На стадиях, непосредственно предшествующих началу перестройки генов антигенраспознающих рецепторов, - CD19+CD76+ про-В-клеток и CD44+CD25+ про-Т-клеток, - экспрессируется Вс1-2 и клетки приобретают устойчивость к индукторам апоптоза, что означает их выход из пула малодифференцированных клеток-предшественников. 

 

Таблица 4

Роль апоптоза на различных этапах развития Т-лимфоцитов

Этап развития

Экспрессия  факторов, связанных с апоптозом

Проявления  апоптоза

Развитие предшественников Т-лимфоцитов (до экспрессии TSR)

В костном мозгу отсутствует  экспрессия Bcl-2, в тимусе на стадии CD25+ - сильная экспрессия Bcl-2, слабая - Fas

До стадии CD25+ апоптоз развивается в отсутствие ИЛ-7 и фактора стволовых клеток; в процессе перестройки генов рецептора – при непродуктивной перестройке

Селекция клонов и дифференцировка субпопуляций

На стадии CD4+CD8+ слабая экспрессия Bcl-2, сильная - Fas, позже - наоборот

CD4+CD8+ тимоциты выживают при условии распознавания аутологичных молекул ГКГ на мембране эпителиальных клеток (положит. селекция), позже тимоциты гибнут при распознавании аутологичных комплексов пептид-молекула ГКГ на поверхности дендритных клеток (отрицат. селекция)

Функционирование  зрелых Т-клеток

На покоящихся клетках сильная экспрессия Bcl-2, но не Fas. Активированные Т-клетки экспрессируют Fas и со временем теряют Bcl-2

Покоящиеся клетки устойчивы  к индукции апоптоза. Активированные клетки гибнут при дефиците сигнала, повторной стимуляции, связывании CD4, в поздние сроки - спонтанно. Цитотоксические клетки индуцируют апоптоз клеток-мишеней


  

Далее следует этап драматических  перестроек генов В- и Т-клеточного рецепторов (BCR, TCR), важной составляющей которых являются разрывы и рекомбинации нитей ДНК. Это само по себе может служить сигналом к развитию апоптоза (с участием фактора р53). Однако высокий уровень экспрессии Bcl-2 и Bcl-xL препятствует этому. Лишь в случае неудачной реализации перестройки рецепторных генов клетка подвергается апоптозу. После завершения перестроек и экспрессии рецепторов (BCR на В-лимфоцитах и TCR на Т-лимфоцитах) происходит резкое снижение экспрессии Bcl-2 и Bcl-xL. Это событие означает начало процесса селекции клонов - выбраковки ненужных и опасных для организма клонов лимфоцитов.

Процесс селекции достаточно полно изучен для Т-клеток. Объектом селекции являются кортикальные тимоциты, слабо экспрессирующие рецепторный комплекс TCR- CD3 и несущие одновременно корецепторы CD4 и CDS. Эти клетки практически лишены Bcl-2 и Bcl-xL, но содержат на своей поверхности Fas-рецептор. Такое соотношение факторов, препятствующих и способствующих развитию апоптоза, обрекает их на гибель в отсутствие специальных факторов защиты. Источником защитных сигналов для них служит взаимодействие их рецептора (TCR) с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), которые экспрессируют эпителиальные клетки микроокружения глубоких слоев коры тимуса - распознавание аутологичных молекул ГКГ. Если клетка несет рецептор, способный распознать эти молекулы (при этом роль встроенного в них пептида пока неясна), она получает “поддерживающий” сигнал, который приводит к усилению экспрессии рецептора TCR, активации и пролиферации клетки. Остальные клетки “игнорируются”, что означает для них неизбежное развитие апоптоза. Пока не вполне ясно, что служит непосредственным сигналом к развитию апоптоза в данном случае - действие глюкокортикоидов и пуриновых нуклеотидов, присутствующих в микроокружении, или активные воздействия со стороны окружающих эпителиальных клеток - всех или определенных их субпопуляций.

Положительная селекция сопряжена с дифференцировкой тимоцитов  на субпопуляции CD4+CD8- и CD4- CD8+ клеток, основой которой является выбор способа распознавания антигенных пептидов - в составе молекулы I класса (в их распознавании участвует молекула CD8) или II класса (распознаваемой с участием CD4). При этом экспрессия корецептора CD4 в сочетании с TCR, распознающим пептид в контексте молекул ГКГ I класса (не комплементарных корецептору), приводит к апоптозу клетки, так же как экспрессия CD8 в сочетании с TCR, распознающим пептид в контексте молекул ГКГ II класса. Причиной развития апоптоза в этом случае может служить “неполнота” сигнала от распознавания молекул ГКГ, который оказывается недостаточным для включения защиты от апоптоза.

После положительной  селекции тимоциты подвергаются второму  туру отбора - отрицательной селекции (пока неясно, как соотносится во времени этот этап селекции и дифференцировка  на субпопуляции). На этой стадии выбраковываются  аутореактивные клетки, т. е. тимоциты, чьи рецепторы распознают аутологичные пептиды в составе аутологичных молекул ГКГ. “Проба” на распознавание осуществляется при контакте тимоцитов, прошедших положительную селекцию и содержащих на своей поверхности больше молекул TCR- CD3, чем на предыдущем этапе развития, с дендритными клетками, богатыми мембранными молекулами ГКГ обоих классов. Пространственно этот процесс приурочен к кортико-медуллярной и, возможно, мозговой зонам. В случае распознавания аутологичного комплекса возникает летальный сигнал, приводящий к развитию апоптоза, т. е. к удалению потенциально аутореактивных клонов. До сих пор нет четкого ответа на вопрос, почему распознавание аутологичных молекул на поверхности эпителиальных клеток защищает тимоциты от апоптоза, а их распознавание на мембране дендритных клеток индуцирует апоптоз тимоцитов. Предполагается, что исход зависит от интенсивности воздействия, определяемой степенью сродства рецептора по отношению к распознаваемому комплексу и плотности молекул TCR и ГКГ на поверхности клеток.

Поскольку не все антигены представлены в тимусе, процесс выбраковки аутореактивных клонов и формирования аутотолерантности продолжается после  эмиграции Т-клеток из тимуса. Однако в этом случае значительная часть  аутоспецифических клеток не погибает, а блокируется вследствие индукции энергии и подавления их активности супрессорными клетками.

Процесс селекции развивающихся  В-лимфоцитов менее изучен. Однако известно, что и они подвергаются двум этапам селекции. При этом положительную  селекцию определяет распознавание неизвестного фактора(ов) микроокружения, тогда как отрицательная селекция происходит аналогично тому, как она осуществляется в популяции Т-клеток.

Реальность процессов  отрицательной селекции ярко продемонстрирована в различных системах с трансфекцией генов, детерминирующих экспрессию неких чужеродных для данного вида молекул и одновременно - рецептора, специфичного в отношении этой молекулы. Поскольку при этом все лимфоциты несут рецептор, специфичный к “аутоантигену”, они становятся объектом отрицательной селекции и полностью элиминируются.

Зрелые Т- и В-лимфоциты, подвергшиеся селекции, в покоящемся состоянии лишены мембранного Fas-рецептора  и экспрессируют протоонкогены  Вс1-2 и Вс1-xl, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза. Положение меняется на обратное при активации лимфоцитов соответствующим антигеном или митогеном. Моноклональные антитела анти-Fas не действуют на покоящиеся лимфоциты и убивают активированные Т- и В-клетки. Активированные лимфоциты могут подвергнуться апоптозу при самых различных воздействиях - повторной стимуляции через перекрестное сшивание рецептора, при недостатке факторов роста (для Т-клеток - ИЛ-2, для В-клеток - главным образом ИЛ-4), действии глюкокортикоидов и т. д. Апоптоз может развиться и в процессе активации - например, после предварительного связывания молекул CD4, при отсутствии костимуляции Т-клеток через CD28, В-клеток через CD40 и ростовых факторов. Дифференцировка В-лимфоцитов в клетки, секретирующие IgG-антитела, происходящая в зародышевых центрах, сопровождается интенсивным мутагенезом (он осуществляется в основном в темных зонах зародышевых центров на стадии центробластов, рис. 5). Конечное назначение мутагенеза в данном случае - появление клонов с более высоким сродством к антигену, чем у исходных В-лимфоцитов. Однако при этом отнюдь не все мутации приводят к повышению сродства рецептора к антигену, а большинство из них даже снижают это сродство. Требуется отбор клонов с высоким сродством рецепторов к антигену и элиминация прочих клонов. Это происходит в базальных участках светлых зон зародышевых центров при взаимодействии В-лимфоцитов (центроцитов) и фолликулярных дендритных клеток, несущих антиген, на фоне ослабления экспрессии Вс1-2 в В-клетках. При сильном сродстве рецептора В-центроцитов к антигену их взаимодействие стабилизируется с помощью связывания молекулы CD40 В-клеток с ее лигандом CD 154 (CD40L), которое служит источником сигнала выживания В-клеток. Лимфоциты, не получившие этого сигнала, гибнут. После завершения этапа селекции центроциты перемещаются в апикальные участки светлых зон, а затем мигрируют в мантию зародышевых центров, где дифференцируются в плазматические клетки-продуценты антител и В-клетки памяти. Уже в апикальном отделе светлых зон в В-клетках проявляется экспрессия Вс1-2; она возрастает в мантийной зоне. На этих этапах клетки В-ряда становятся устойчивыми к индукторам апоптоза.

После дифференцировки  Т-лимфоцитов в эффекторные клетки - цитотоксические Т-лимфоциты, Т-клетки продуценты цитокинов, а также Т-клетки памяти в них также экспрессируется Вс1-2, и они временно приобретают устойчивость к индукторам апоптоза. Однако эффекторные клетки, несущие маркер CD45RO, все-таки легче направить на путь апоптоза, чем “наивные” Т-лимфоциты, несущие маркер CD45RA. Кроме того, экспрессия Вс1-2 в эффекторных клетках иммунной системы как Т-, так и В-типа продолжается недолго. Ее прекращение неизбежно приводит к гибели клеток. В клетках памяти экспрессия “защитных” протоонкогенов типа Bcl-2 продолжается дольше, что обусловливает длительный срок их жизни. Особенно стабильной оказывается экспрессия Bcl-2 и долгим срок жизни клеток памяти, если они периодически испытывают воздействие специфического антигена, локализующегося на поверхности дендритных клеток зародышевых центров.

Известно еще по меньшей  мере два аспекта функционирования лимфоцитов, непосредственно связанных  с проявлениями апоптоза. Один из этих аспектов - реализация цитотоксической  активности лимфоцитов. Клетки-мишени и естественных киллеров, и цитотоксических Т-лимфоцитов гибнут при морфологических и биохимических проявлениях апоптоза, хотя при этом примешиваются некоторые черты некротической  

Рис. 5. Схема  строения зародышевого центра, экспрессии Bcl-2 в различных его зонах и  процессов, в которые вовлекаются в этих зонах В-лимфоциты   

гибели клеток. Эта  двойственная природа гибели с преобладанием  апоптоза может быть проанализирована на примере наиболее универсального механизма действия киллеров, состоящего в формировании в мембране клетки-мишени пор, образованных вследствие полимеризации перфорина, и поступления через эти поры сериновых протеаз — гранзимов (главным образом гранзима В), который включает механизм апоптоза. Перфориновые поры, как правило, недостаточны для того, чтобы нарушить ионный гомеостаз клетки и вызвать ее отек и разрыв мембраны, хотя в определенный момент могут включиться и эти процессы. Однако раньше успевают сработать эффекты, обусловленные “впрыскиванием” гранзимов, которые проявляются в форме апоптоза. Среди других механизмов цитотоксического действия Т-лимфоцитов (но не NK-клеток) могут быть названы Fas-опосредованный апоптоз (клетки-мишени экспрессируют Fas-рецептор, а цитотоксические Т-лимфоциты - Fas-лиганд) и апоптоз, индуцируемый фактором некроза опухоли или лимфотоксином через рецептор 1 типа (TCRF1).

Другая область функционирования иммунной системы, для которой оказалась  важной реализация апоптоза, — изоляция “иммунологически привилегированных” зон от проявлений активности эффекторных  клеток иммунной системы. Недавно выяснилось, что по крайне мере две такие зоны - внутренние среды глаза и семенников - выстланы клетками, экспрессируюшими Fas-лиганд. В глазу его несут клетки эпителия, эндотелия, радужки, сетчатки, ресничных телец, в семенниках — эпителиальные, эндотелиальные и сертолиевы клетки. В результате эффекторные Т-лимфоциты, экспрессирующие Fas-рецептор, неизбежно гибнут в процессе миграции через этот барьер вследствие взаимодействия этого рецептора с Fas-лигандом барьерных клеток, приводящего к реализации апоптоза агрессивных мигрантов.

Таким образом, апоптоз  является одним из ключевых процессов, определяющих формирование антигеноспецифической  составляющей иммунной системы и  в значительной степени — реализацию ее эффекторных функций. В особенности  важной оказывается роль апоптоза и обеспечении неотвечаемости лимфоцитов в отношении собственных компонентов организма, что достигается, с одной стороны, путем формирования аутотолерантности вследствие апоптоза аутореактивных клонов лимфоцитов, с другой - путем исключения некоторых областей организма из-под контроля иммунной системы с помощью заслона, преодолевая который, активированные клетки подвергаются апоптозу.

4. Патология,  обусловленная нарушениями апоптоза

Материал предшествующих глав свидетельствует о том, что  в реализации и контроле апоптоза участвуют многочисленные внутриклеточные факторы, он может быть вызван действием разнообразных внешних агентов, и от его осуществления зависят многие важные процессы, реализуемые на уровне организма. Из этого следует неизбежность существования патологии, связанной с нарушениями в звеньях индукции и регуляции апоптоза. Хотя этот аспект патологии привлек к себе внимание относительно недавно и не подвергнут исчерпывающему изучению, накопленных данных достаточно, чтобы с определенностью подтвердить высказанное выше суждение. Далее мы рассмотрим две группы патологических процессов, связанных с ослаблением и усилением апоптоза (табл. 5). 

4.1. Патологические процессы, обусловленные  ослаблением апоптоза

На основании знаний о роли апоптоза в осуществлении физиологических процессов можно предположить, что недостаточность проявления апоптоза должна отразиться на процессах морфогенеза, элиминации клеток с генетическими поломками, становлении аутотолерантности и проявляться в форме разного рода дефектов развития, аутоиммунных процессах и злокачественных опухолях. Однако моделирование ослабления апоптоза путем трансфекции мышам гена bcl-2 в форме, предусматривающей его спонтанную экспрессию во всех или в определенных клетках, показало, что спектр проявляющихся при этом дефектов уже, чем можно было ожидать. Основное последствие гиперэкспрессии Bcl-2 состоит в развитии системных аутоиммунных процессов (вплоть до волчаночного синдрома), а также в накоплении необычных клеток Т-ряда с фенотипом CD3-TCRa b +CD4- CD8- B220+ (т. е. лишенных корецепторов и несущих маркер В-клеток В220), в норме обнаруживаемых в ограниченном количестве лишь в некоторых органах, например, в печени. У таких мышей не наблюдалось повышения частоты развития злокачественных опухолей. Лишь при одновременной гиперэкспрессии трансфецированного гена с-mус у мышей наряду с аутоиммунными развивались лимфопролиферативные процессы.

Патология, фенотипически  идентичная описанной выше для мышей  с гиперэкспрессией Bcl-2, была описана  ранее у мышей линии MRL, несущих мутации Ipr (lymphoprolifеration) и gld (generalized limphoproliferative disease), которые используются в качестве моделей системных аутоиммунных процессов, в частности системной красной волчанки. Генетический анализ показал, что мутация Ipr затрагивает ген Fas-рецептора, а мутация gld - ген Fas-лиганда. У этих мышей с возрастом определяется широкий спектр аутоантител, в том числе к нативной ДНК, развивается аутоиммунный гломерулонефрит, гипертрофируются периферические лимфоидные органы с накоплением в них Т-клеток указанного выше мембранного фенотипа, что и обозначается как лимфопролиферативный синдром, хотя он и лишен признаков злокачественности. Существенно, что селекция клонов Т-лимфоцитов в тимусе этих мышей происходит, хотя и медленнее, чем в норме, тогда как селекция на периферии отменяется полностью. Таким образом, во-первых, нарушение экспрессии Fas-рецептора и Fas-лиганда имеет сходные последствия, проявляющиеся в нарушении формирования аутотолерантности и экспансии субпопуляции Т-клеток с неизвестной функцией, в норме имеющей ограниченное распределение в иммунной системе; во-вторых, эти же последствия наблюдаются при повышенной экспрессии фактора Bcl-2, ограничивающего апоптоз; в-третьих, от экспрессии Fas и Bcl-2 сильнее зависит селекция клонов Т-лимфоцитов на периферии, чем в тимусе.

Поскольку среди последствий  генетически обусловленного ослабления апоптоза в иммунной системе доминируют проявления системной аутоиммунной патологии, возник вопрос о состоянии  апоптоза и связанных с ним факторов при аутоиммунных заболеваниях человека, прежде всего при системной красной волчанке. Прямые нарушения экспрессии Fas-рецептора и Bcl-2 или других представителей этого семейства при коллагенозах, как правило, не обнаруживается; выявлен единичный случай мутации гена Fas-лиганда. В то же время описан семейный аутоиммунный лимфопролиферативный синдром с генетическим дефектом Fas-рецептора.

Хотя при системной  красной волчанке апоптоз лимфоцитов при соответствующих условиях осуществляется, при этом заболевании и некоторых других коллагенозах (например, ювенильном ревматоидном артрите) обнаружена усиленная выработка растворимой формы Fas-рецептора, накопление которого в микроокружении лимфоцитов может препятствовать реализации Fas-зависимого апоптоза, например, апоптоза активированных лимфоцитов или Т-клеток, подвергающихся отрицательной селекции на периферии. Нами показано, что у части больных системной красной волчанкой для включения активационного апоптоза требуется присутствие клеток-индукторов в количестве на 2 порядка большем, чем требуется для развития апоптоза активированных Т-клеток здоровых людей. Образование растворимой формы Fas-рецептора особенно характерно для острого Т-лимфобластного лейкоза. Оно обусловлено альтернативным сплайсингом транскриптов гена fas, что приводит к формированию белка, лишенного трансмембранного участка.

Данные об изменениях в чувствительности к индукции апоптоза различных типов клеток при системной  красной волчанке противоречивы. При  волчаночном нефрите подавляется  апоптоз клеток клубочков. С другой стороны, при системной красной волчанке нередко повышается экспрессия FasL и регистрируется усиление апоптоза лимфоцитов in vitro, что коррелирует с усилением их спонтанной активации.

При ревматоидном артрите  Т-лимфоциты, присутствующие в пораженной суставной полости, имеют все признаки, “обрекающие” их на развитие апоптоза (в частности, высокую экспрессию Fas-рецептора и низкую - Bcl-2), однако не подвергающиеся ему; предполагается, что в данном случае срабатывает некий механизм, препятствующий реализации апоптоза лимфоцитов (нейтрофилы в суставных полостях тех же больныx подвергаются массовому апоптозу). При болезни Бехчета с увеоретинитом ослаблена экспрессия Fas-рецептора на активированных CD4+ Т-клетках, что свидетельствует о потенциальном снижении их чувствительности к индукции апоптоза.

Принципиально важная закономерность была установлена при анализе  мишеней аутоантител при системной  красной волчанке. Оказалось, что  они одновременно являются мишенями действия сериновых протеаз (каспаз), обусловливающих включение эффекторного механизма апоптоза (см. раздел 1.4). Кроме того, аутоантитела при данном и родственных заболеваниях направлены против серин-треониновых киназ, которые активируются при клеточном стрессе.

Вторую большую группу заболеваний, к генезу которых имеет отношение подавление апоптоза, образуют злокачественные опухоли, особенно имеющие гематогенное происхождение. В этом случае ключевым событием, способствующим развитию патологии, чаще всего служат соматические мутации, затрагивающие ген р53 (обычно его экзоны 5-8). Выше упоминалось, что фактор р53 трансформирует сигнал о нерепарированных разрывах цепей ДНК в сигнал к развитию апоптоза. Благодаря этому элиминируются клетки с повреждениями генетического аппарата, спонтанными или индуцированными (например, облученными). В нормальных клетках белок р53 не выявляется, а при опухолях его мутантную форму экспрессирует до 70% трансформированных клеток. Однако большой разброс частоты мутаций р53 при различных злокачественных опухолях не позволяет сделать универсального заключения относительно его роли в патогенезе злокачественных процессов.

Аномалии фактора р53, а также других внутриклеточных  факторов, контролирующих апоптоз, в  процессе развития опухоли имеют  отношение к ее прогрессированию. Лишившись такого контроля, клетки, утрачивающие связи с межклеточным матриксом и другими факторами нормального микроокружения, не гибнут, а благополучно развиваются в чужой для них среде, что способствует метастазированию опухолей.

Общеизвестным является факт рекомбинации гена bcl-2, при лимфоме Беркитта и некоторых формах фолликулярных лимфом, когда он транслоцируется из хромосомы 18 в ген Igh хромосомы 14. При тех же типах лимфом выявляется также аналогичное перемещение гена с-mус из хромосомы 8 в тот же локус Igh. He вызывает сомнений связь патогенеза с этими транслокациями, которая реализуется через повышение резистентности измененных клеток к индукции апоптоза.

Изменения р53, гиперэкспрессия  Вс1-1 и Вс1-xl, активация каспаз являются основой формирования устойчивости к лечебным воздействиям, основанным на индукции апоптоза опухолевых клеток - рентгено- и радиотерапии, химиопрепаратам. Наиболее полной формой таковой резистентности является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток. 

4.2. Патологические процессы, связанные  с усилением апоптоза

Заболеваниям, основой  которых является усиление апоптоза клеток организма, принадлежит, по-видимому, не меньшее место в патологии. Наиболее выраженные формы такого рода нарушений, при которых в процесс апоптоза тотально вовлекаются клетки любых типов, обычно несовместимы с развитием плода и приводят к внутриутробной гибели. Отмечаются лишь те локальные формы расстройств такого рода, проявляющиеся как дефекты развития с формированием "минус-ткани" (например, волчьей пасти). Наиболее распространенными вариантами патологии такого рода в сформировавшемся организме являются разного рода аплазии и дегенеративные процессы.

Наиболее разнообразные  их формы описаны в области  патологии системы крови. Чаще всего они развиваются вследствие недостаточности факторов выживания костномозговых клеток-предшественников. Так, в эксперименте направленная инактивация гена ИЛ-7 приводит к тотальной лимфопении, в значительной степени связанной с гибелью предшественников В- и Т-лимфоцитов на стадиях, предшествующих формированию антигенраспознающих рецепторов. Аналогичные причины лежат в основе апластической анемии, анемии при дефиците железа, фолатов, витамина В12 талассемии, тромбоцитопении, нейтропении, панцитопении, хотя конкретные механизмы гибели клеток-предшественников в этих случаях отнюдь не всегда установлены. Отключение генов факторов выживания в ряде случаев не приводит к указанным последствиям в силу избыточности контроля выживания клеток. Особенно пристально изучается роль апоптоза в патогенезе миелодиспластических процессов, приводящих к панцитопении в результате апоптоза стволовых клеток и ранних кроветворных предшественников. Повышенная готовность к развитию апоптоза Т-лимфоцитов обнаружена при мультицентрической болезни Кастлемана.

Большую группу заболеваний, связанных с усилением апоптоза, образуют инфекционные процессы. Индукторами  апоптоза служат бактериальные эндотоксины (например, липополисахарид кишечных микробов) и экзотоксины (в частности, стафилококков, бордетелл и т. д.). Массовый апоптоз, опосредованный фактором некроза опухоли и его рецепторами I типа, развивается при сепсисе. При вирусных инфекциях сосуществуют факторы, индуцирующие и ингибирующие апоптоз (вирусам “не выгодна” тотальная гибель клеток-мишеней). Особая ситуация складывается при СПИДе. Установлено, что доля инфицированных клеток среди гибнущих Т-лимфоцитов невелика. Показано, что гибель лимфоцитов происходит по механизму апоптоза и ее выраженность коррелирует с быстрой прогрессией заболевания. Апоптозу подвергаются предварительно активированные лимфоциты, в основном несущие маркер клеток памяти CD45RO. Полагают, что одним из механизмов, повышающих их чувствительность к активационному апоптозу, может быть перекрестное связывание молекул CD4 мембранным гликопротеином ВИЧ-1 gp120 (что моделируется при действии на Т-клетки моноклональных антител к CD4). Определенную роль в активационном апоптозе CD4+ клеток играет корецептор CD28, поскольку антитела к этой молекуле предотвращают гибель Т-клеток больных СПИДом. Более того, CD4+ клетки, инфицированные вирусом ВИЧ-1, менее чувствительны к индукции апоптоза, поскольку один из вирусных белков - Nef - подавляет его развитие.

Другим примером болезней, связанных с усилением апоптоза, являются заболевания нервной системы, вызываемые атрофией определенных ее участков. Как правило, эта атрофия является следствием индукции апоптоза. К таким заболеваниям относятся боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, спинальная мышечная атрофия и другие заболевания нервной системы. Идентифицирован “ген болезни Альцгеймера”, продукт которого оказался транскрипционным фактором D LG-2.

Существует ряд других заболеваний, при которых в реализации основного поражения решающая роль принадлежит апоптозу. Их примером может служить инфаркт миокарда (апоптоз является преобладающей формой гибели миоцитов в ранний период развития инфаркта), токсический (в частности, алкогольный) гепатит и т. д.

Со временем увеличивается  доля патологических процессов, основывающихся на усилении апоптоза, которое вызвано действием внешних апоптогенных факторов. На первом месте среди них находится ионизирующая радиация. В связи с тем, что она индуцирует апоптоз по преимуществу лимфоидных клеток, эта сторона ее действия проявляется в иммунной недостаточности, хотя вызываемые облучением нарушения кроветворения по крайней мере частично обусловлены индукцией апоптоза клеток-предшественников. Аналогичный эффект дают многие химиотерапевтические препараты, используемые при лечении опухолей, а также гормоны, прежде всего глюкокортикоиды, широко применяемые при лечении различных заболеваний. Источником апоптогенных факторов служит внешняя среда. Нормальное окружение человека практически не является источником апоптогенных воздействий, однако при формировании экологического неблагополучия во внешней среде накапливаются факторы, моделирующие или вызывающие развитие апоптоза. Наиболее ярким примером агрессивных факторов, загрязняющих среду, которые способны вызвать гибель клеток путем индукции апоптоза, относится диоксан, повреждающий, в частности, эпителиальные клетки тимуса.

Таким образом, в основе достаточно большого числа патологических процессов лежат нарушения процесса апоптоза. У взрослых могут регистрироваться лишь дефекты с ограниченными фенотипическими проявлениями, поскольку организмы с обширными дефектами такого рода гибнут на ранних этапах онтогенеза. Наиболее характерным проявлением недостаточности апоптоза служит развитие аутоиммунных процессов и злокачественных новообразований, проявлениями усиленного апоптоза - аплазии и дегенеративные процессы, а также некоторые уродства с дефектами тканей. 

Заключение

Сосредоточение значительных усилий исследователей на изучении апоптоза позволило и относительно короткий срок (с начала 90-х годов) осуществить прорыв в анализе его молекулярных механизмов. Особенно существенные успехи достигнуты в понимании структуры и функционирования Fas-рецептора и связанных с ним молекул, факторов, контролирующих апоптоз (Вс1-2, Вах и т. д.), сериновых протеаз (каспаз). В то же время с полной определенностью не установлена природа эндонуклеаз, осуществляющих расщепление ДНК при апоптозе, и не выяснено, каким образом протеолиз, осуществляемый каспазами, приводит к активации этих эндонуклеаз.

Параллельно накапливаются сведения о месте апоптоза в развитии организма и деятельности его функциональных систем, в особенности иммунной. Наконец, в последние годы началось широкомасштабное изучение места апоптоза и его нарушений в развитии патологических процессов. Показана его реальная роль в патогенезе нервных заболеваний, аутоиммунных, опухолевых процессов и другой патологии. Особую важность приобрела проблема устойчивости опухолевых клеток к лекарственным средствам, обусловленной нарушением апоптоза. Эти направления исследований смыкаются с разработкой подходов к генотерапии заболеваний человека. 

Рекомендуемая литература

1. Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. // Рос. онкол. журн. —

1996. — № 1. — С. 58—61.

2. Программированная  клеточная гибель / Под ред. В.  С.

Новикова. — СПб., 1996.

3. Ярыгин А. А. Иммунология.  — 1996. — № 6. — С. 10-23.

4. Green D. R., Bissonnette R. P., Glynn J.M., Shi Y. // Semin.

Immunol. - 1992. — Vol. 4. —  P. 379—388.

5. Griffiths T. S., Fergtison T. A. // Immmunol. Today. — 1997. —

Vol. IS. - P. 240-243.

6. Hockenbery D. M. // Semin. Immunol. —  1992. — Vol. 4. —

P. 413-420.

7. Kerr J. R., Winierford C. M., Hartnon B. Y. // Cancer (Philad.). -

1994. — Vol. 73. — P. 2013-2016.

8. Kroemer G. // Aclvanc. Immunol. — 1995. — Vol. 58. —

P. 211-296.

9. Kroemer G., Zamzami N.. Susin S. A. // Immunol. Today. —

1997. — Vol. 18. - P. 44—51.



Информация о работе Программируемая клеточная смерть