Дыхание растений

В последние годы в результате изучения пространственного расположения компонентов ЭТЦ во внутренней мембране митохондрии показано что комплексы I, III и IV пересекают мембрану. На внутренней стороне мембраны, обращенной к матриксу, два электрона и два протона  от НАДH поступают на флавинмононуклеотид  комплекса I.

Электроны передаются на FeS-центры. Пара электронов от FeS-центров захватывается  двумя молекулами окисленного убихинона, которые принимают два иона Н ⁺ , образуя семихиноны (2QH) и диффундируя к комплексу III. На эти семихиноны поступает еще пара электронов от цитохрома Ь₅₆₀комплекса III, что делает возможной реакцию семихинонов с еще двумя протонами из мАТФикса с образованием 2QH₂. Полностью восстановленный убихинон (убихинол) отдает 2е~ цитохрому Ь₅₅₆ и 2е~FeS_R — цитохрому с,. В результате освобождаются четыре иона Н⁺, выходящие в межмембранное пространство митохондрии. Окисленные молекулы убихинона вновь диффундируют к комплексу I и готовы принимать от него (или от комплекса II) новые электроны и протоны. Таким образом, цитохромы Ь служат донорами двух электронов для переноса двух дополнительных протонов через липидную фазу мембраны на каждые два электрона, поступающие из комплекса I.

Водорастворимый цитохром с на наружной стороне мембраны, получив 2е~ от FeS_R — цитохрома c_iyпередает их на цитохром а — Сид комплекса IV. Цитохром а₃ — Си_в, связывая кислород, переносит на него эти электроны, в результате чего с участием двух протонов образуется вода. Как уже отмечалось, цитохромоксидазный комплекс способен также переносить ионы Н⁺ через митохондриальную мембрану.

Таким образом, из матрикса митохондрии  при транспорте каждой пары электронов от НАДH к 1/2 0₂в трех участках ЭТЦ (комплексы I, III, IV) через мембрану наружу переносятся по крайней мере шесть протонов. Как будет показано далее, именно в этих трех участках окислительные процессы в ЭТЦ сопрягаются с синтезом АТФ. Передача 2е~ от сукцината на убихинон в комплексе II не сопровождается трансмембранным переносом протонов. Это приводит к тому, что при использовании сукцината в качестве дыхательного субстрата в ЭТЦ остаются лишь два участка, в которых функционирует протонная помпа.

Рис. 8. Предполагаемое расположение компонентов цепи переноса электронов во внутренней мембране митохондрий  в соответствии с хемиосинтетической теорией Митчелла

Особенностью растительных митохондрий (отличающей их от митохондрий  животных) является способность окислять экзогенный НАДH, т. е. НАДH, поступающий  из цитоплазмы. Это окисление осуществляется по крайней мере двумя флавиновыми  НАДH-дегидрогеназами, из которых одна локализована на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий, а другая —  в их наружной мембране. Первая из них  передает электроны в ЭТЦ митохондрий  на убихинон, а вторая — на цитохром с. Для функционирования НАДH- дегидрогенэзы  на наружной стороне внутренней мембраны необходимо присутствие кальция.

Другое существенное отличие  растительных митохондрий состоит  в том, что во внутренней мембране помимо основного (цитохромного) пути переноса электронов имеется альтернативный путь переносае~, устойчивый к действию цианида.

Перенос электронов от НАДH к  молекулярному кислороду через  ЭТЦ митохондрий сопровождается потерей свободной энергии. Какова судьба этой энергии? Еще в 1931 г. В. А. Энгельгардт показал, что при  аэробном дыхании накапливается  АТФ. Он первый высказал идею о сопряжении между фосфорилированием АДФ  и аэробным дыханием. В 1937—1939 гг. биохимики  В. А. Белицер в СССР и Г. Калькар  в США установили, что при окислении  промежуточных продуктов цикла  Кребса, в частности янтарной и  лимонной кислот, суспензиями животных тканей исчезает неорганический фосфат и образуется АТФ. В анаэробных условиях или при подавлении дыхания цианидом такого фосфорилирования не происходит. Процесс фосфорилирования АДФ с  образованием АТФ, сопряженный с  переносом электронов по ЭТЦ митохондрий, получил название окислительного фосфорилирования.

По поводу механизма окислительного фосфорилирования существуют три теории: химическая, механохимическая (конформационная) и хемиосмотическая.

Химическая и  механохимическая гипотезы сопряжения. Согласно химической гипотезе в митохондриях имеются интермедиаторы белковой природы (X, Y, Z), образующие комплексы с соответствующими восстановленными переносчиками. В результате окисления переносчика в комплексе возникает высокоэнергетическая связь. При распаде комплекса к интермедиатору с высокоэнергетической связью присоединяется неорганический фосфат, который затем передается на АДФ:

Однако несмотря на упорные  поиски, не удалось выделить или  как-то иначе доказать реальное существование  постулированных высокоэнергетических интермедиаторов типа X ~ P. Гипотеза химического сопряжения не объясняет, почему окислительное фосфорилирование обнаруживается только в препаратах митохондрий с ненарушенными  мембранами. И, наконец, с позиций  этой гипотезы не находит объяснения способность митохондрий подкислять внешнюю среду и изменять свой объем в зависимости от степени  их энергизации.

Способность митохондриальных мембран к конформационным изменениям и связь этих изменений со степенью энергизации митохондрий послужила  основой для создания механохимических гипотез образования АТФ в  ходе окислительного фосфорилирования. Согласно этим гипотезам энергия, высвобождающаяся в процессе переноса электронов, непосредственно  используется для перевода белков внутренней мембраны митохондрий в новое, богатое  энергией конформационное состояние, приводящее к образованию АТФ. Одна из гипотез подобного рода, выдвинутая американским биохимиком П. Д. Бойером (1965), может быть представлена в виде следующей схемы:

Автор предположил, что запасание  энергии происходит путем конформационных  изменений ферментов ЭТЦ аналогично тому, как это наблюдается в  белках мышц. Актомиозиновый комплекс сокращается, гидролизуя АТФ. Если сокращение белкового комплекса достигается  за счет другой формы энергии (за счет окисления), то расслабление, возможно, будет сопровождаться синтезом АТФ.

Таким образом, согласно механохимическим гипотезам, энергия окисления превращается сначала в механическую энергию, а затем в энергию высокоэнергетической связи АТФ. Однако, подобно химической теории сопряжения, механохимические гипотезы также не могут объяснить  подкисление митохондриями окружающей среды.

Хемиосмотическая  теория сопряжения. В настоящее время наибольшим признанием пользуется хемиосмотическая теория английского биохимика П. Митчелла (1961). Он высказал предположение, что поток электронов через систему молекул-переносчиков сопровождается транспортом ионов Н⁺ через внутреннюю мембрану митохондрий. В результате на мембране создается электрохимический потенциал ионов Н ⁺ , включающий химический, или осмотический, градиент и электрический градиент (мембранный потенциал). Согласно хемиосмотической теории электрохимический трансмембранный потенциал ионов Н⁺ и является источником энергии для синтеза АТФ за счет обращения транспорта ионов Н⁺ через протонный канал мембранной Н ⁺ -АТФазы.

Теория Митчелла исходит  из того, что переносчики перешнуровывают  мембрану, чередуясь таким образом, что в од сторону возможен перенос  и электронов, и протонов, а в  об ратную — только электронов. В  результате ионы Н⁺ накапливаются на одной стороне мембраны. 

Между двумя сторонами  внутренней митохондриальной мембраны в результате направленного движения протонов против концентрационного  градиента возникает электрохимический  потенциала Энергия, запасенная таким  образом, используется для синтеза  АТФ как результат разрядки мембраны при обратном (по концентрационному  градиенту) транспорте протонов через  АТФазу, которая работает в этом случае как АТФ-синтетаза.

За прошедший период хемиосмотическая гипотеза Митчелла получила целый ряд  экспериментальных подтверждений. Одним из доказательств роли протонного градиента в образовании АТФ  при окислительном фосфорилировании может служить разобщающее действие на этот процесс некоторых веществ. Известно, что 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) подавляет  синтез АТФ, но стимулирует транспорт  электронов (поглощение 0₂), т. е. разобщает дыхание (окисление) и фосфорилирование. Митчелл предположил, что такое действие 2,4-ДНФ связано с тем, что он переносит протоны через мембрану (т. е. является протонофором) и поэтому разряжает ее. Это предположение полностью подтвердилось. Оказалось, что разные по своей химической природе вещества, разобщающие окисление и фосфорилирование, сходны в том, что, во-первых, они растворимы в липидной фазе мембраны, а, во-вторых, это слабые кислоты, т. е. легко приобретают и теряют протон в зависимости от рН среды. В. П. Скулачев на искусственных фосфолипидных мембранах показал, что чем легче вещество переносит протоны через мембрану, тем сильнее разобщает эти процессы. Другое экспериментальное подтверждение роли протонного градиента в фосфорилировании было получено Митчеллом, который сообщил о синтезе АТФ в митохондриях в результате замены щелочной инкубационной среды на кислую (т. е. в условиях искусственно созданного трансмембранного градиента ионов Н⁺).

В 1973 г. Э. Рэкеру (США) удалось  получить липосомы (везикулы из фосфолипидов), в которые была встроена АТФаза, выделенная из митохондрий сердца быка, и хромопротеин галофильной бактерииHalobacterium halobium — бактериородопсин, обусловливающий создание протонного градиента за счет энергии света. Фосфолипиды для реконструкции мембран этих липосом были выделены из растений (соевые бобы). Полученные таким образом гибридные пузырьки на свету осуществляли фосфорилирование.

6.АТФ как основная  энергетическая валюта клетки, её  структура и функции. Механизмы  синтеза АТФ

Процессы обмена вещества включают в себя реакции, идущие с  потреблением энергии, и реакции  с выделением энергии. В некоторых  случаях эти реакции сопряжены. Однако часто реакции, в которых  энергия выделяется, отделены в пространстве и во времени от реакций, в которых  она потребляется. В процессе эволюции у растительных и животных организмов выработалась возможность хранения энергии в форме соединений, обладающих богатыми энергией-связями. Среди них  центральное место занимает аденозинтрифосфат (АТФ). АТФ представляет собой нуклеотидфосфат, состоящий из азотистого основания (аденина), пентозы (рибозы) и трех молекул  фосфорной кислоты. Две концевые молекулы фосфорной кислоты образуют макроэргические, богатые энергией связи. В клетке АТФ содержится главным  образом в виде комплекса с  ионами магния. Аденозинтрифосфат в  процессе дыхания образуется из аденозиндифосфата  и остатка неорганической фосфорной  кислоты (Фн) с использованием энергии, освобождающейся при окислении  различных органических веществ:

АДФ + ФН --> АТФ + Н2О

При этом энергия окисления  органических соединении превращается в энергию фосфорной связи.

В 1939—1940 гг. Ф. Липман установил, что АТФ служит главным нереносчиком энергии в клетке. Особые свойства этого вещества определяются тем, что  конечная фосфатная группа легко  переноситься с АТФ на другие соединения или отщепляется с выделением энергии, которая может быть использована на физиологические функции. Эта  энергия представляет собой разность между свободной энергией АТФ  и свободной энергией образующихся продуктов (AG). AG — это изменение  свободной энергии системы или  количество избыточной энергии, которая  освобождается при реорганизации  химических связей. Распад АТФ происходит по уравнению AТФ + Н20 = АДФ + ФН, при этом происходит как бы разрядка аккумулятора, при рН 7 выделяется AG = —30,6 кДж. Этот процесс катализируется ферментом  аденозинтрифосфатазой - (АТФ-аза) Равновесие гидролиза АТФ смещено в сторону  завершения peaкции, что и обусловливает  большую отрицательную величину свободной энергии гидролиза. Это  связано с тем, что при диссоциации. Четырех гидроксильных группировок  при рН 7 АТФ имеет четыре отрицательных  заряда. Близкое расположение зарядов  друг к другу способствует их отталкиванию и, следовательно, отщеплению фосфатных  группировок. В результате гидролиза  образуются соединения с одноименным  зарядом (АДФ3~ и НР04~), которые отживаются друг от друга, что препятствует их соединению. Уникальные свойства АТФ  объясняются не только тем, что при  ее гидролизе выделяется большое  количество энергии, но и тем, что  она обладает способностью отдавать концевую фосфатную группу вместе с  запасом энергии на другие органические соединения. Энергия, заключенная в  макроэргической фосфорной связи, используется на физиологическую деятельность клетки. Вместе с тем по величине свободной энергии гидролиза  — 30,6 кДж/моль АТФ занимает промежуточное  положение. Благодаря этому система  АТФ — АДФ может служить  носчиком фосфатных групп от фосфорных  соединений с более высокой энергией гидролиза, например фосфоенолпируват (53,6 К/моль), к соединениям с более  низкой энергией гидролиза, пример сахарофосфатам (13,8 кДж/моль). Таким образом, система  АДФ является как бы промежуточной  или сопрягающей.

Механизм синтеза АТФ. Сопряжение диффузии протонов назад через внутреннюю мембрану митохондрии с синтезом АТФ осуществляется с помощью АТФазного комплекса, получившего названиефактора сопряжения F,. На электронно- микроскопических снимках эти факторы выглядят глобулярными образованиями грибовидной формы на внутренней мембране митохондрий, причем их «головки» выступают в матрикс. F₁ — водорастворимый белок, состоящий из 9 субъединиц пяти различных типов. Белок представляет собой АТФазу и связан с мембраной через другой белковый комплекс F₀, который перешнуровывает мембрану. F₀ не проявляет каталитической активности, а служит каналом для транспорта ионов Н⁺ через мембрану к F_x.

Механизм синтеза АТФ  в комплексе Fi~ F₀ до конца не выяснен. На этот счет имеется ряд гипотез.

Одна из гипотез, объясняющих  образование АТФ посредством  так называемого прямого механизма,была предложена Митчеллом.

Рис. 9. Возможные механизмы  образования АТФ в комплексе F₁ – F₀

По этой схеме на первом этапе фосфорилирования фосфатный  ион и АДФ связываются с  г компонентом ферментного комплекса (А). Протоны перемещаются через канал в F₀-компоненте и соединяются в фосфате с одним из атомов кислорода, который удаляется в виде молекулы воды (Б).Атом кислорода АДФ соединяется с атомом фосфора, образуя АТФ, после чего молекула АТФ отделяется от фермента (В).

Для косвенного механизма возможны различные варианты. АДФ и неорганический фосфат присоединяются к активному центру фермента без притока, свободной энергии. Ионы Н ⁺ , перемещаясь по протонному каналу по градиенту своего электрохимического потенциала, связываются в определенных участках F_b вызывая конформационныё. изменения фермента (П. Бойер), в результате чего из АДФ, и Р_i синтезируется АТФ. Выход протонов в матрикс сопровождается возвратом АТФ-синтетазного комплекса в исходное конформационное состояние и освобождением АТФ.

В энергизованном виде F₁ функционирует как АТФ-синтетаза. При отсутствии сопряжения между электрохимическим потенциалом ионов Н⁺ и синтезом АТФ энергия, освобождающаяся в результате обратного транспорта ионов Н⁺ в матриксе, может превращаться в теплоту. Иногда это приносит пользу, так как повышение температуры в клетках активирует работу ферментов.

7. Митохондрии  как органоиды дыхания. Их структура  и функции

Митохондрии — «силовые»  станции клетки, в них локализована большая часть реакций дыхания (аэробная фаза). В митохондриях происходит аккумуляция энергии дыхания  в аденозинтрифосфате (АТФ). Энергия, запасаемая в АТФ, служит основным источником для физиологической деятельности клетки. Митохондрии обычно имеют  удлиненную палочковидную форму  длиной 4—7 мкм и диаметром 0,5-2 мкм. Число митохондрий в клетке может  быть различным, от 500 до 1000. Однако в  некоторых организмах (дрожжах) имеется  лишь одна гигантская митохондрия. Химический состав митохондрий несколько колеблется. В основном это белковолипоидные органеллы. Содержание белка в них  составляет 60—65%. В состав мембран  митохондрий входят 50% структурных  белков и 50% ферментативных, около 30% липидов. Очень важно, что митохондрии  содержат нуклеиновые кислоты: РНК—1% и ДНК—0,5%. В митохондриях имеется  не только ДНК, но и вся система  синтеза белка, втом числе и рибосомы. Митохондрии окружены двойной мембраной? Толщина мембран составляет 6—10 нм. Между мембранами — перимитохондрлальное пространство, равное 10 нм; оно заполнено  жидкостью типа сыворотки. Внутреннее пространство митохондрий заполняет  матрикс в виде студнеобразной полужидкой массы. В матриксе сосредоточены  ферменты цикла Кребса.