Методы расщепления белков и пептидов

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 04 Октября 2013 в 19:26, реферат

Краткое описание

Пептиды – это семейство веществ, молекулы которых построены из остатков α-аминокислот, соединённых в цепь пептидными (амидными) связями —CO-NH—. Природные полипептиды, состоящие из сотен аминокислот, с молекулярной массой более 6000 дальтон называют белками. Препараты высокоочищенных белков находят разнообразное применение в научных исследованиях, медицине и биотехнологии. Так как многие белки, и в особенности глобулярные, высоколабильны (подвижны), выделение проводят с помощью предельно мягких методов и при пониженной температуре (0-5°С). Критерием чистоты белков является его гомогенность при электрофорезе, хроматографии и центрифугирование. В данный момент белки и пептиды из смеси можно выделить несколькими способами.

Содержание

Введение
Методы разделения белков и пептидов.
Диализ.
Гель-хроматография.
Афинная хроматография.
Ионообменная хроматография.
Адсорбционная хроматография.
Распределительная хроматография.
Ультрацентрифугирование.
Электрофорез.
Изоэлетрофокусирование.
Заключение.
Список использованной литературы.

Вложенные файлы: 1 файл

Введение.docx

— 38.44 Кб (Скачать файл)

Государственное образовательное  учреждение высшего профессионального образования

«Петрозаводский государственный  университет» (ПетрГУ)

Медицинский факультет

Кафедра молекулярной биологии, биологической и органической химии.

 

 

 

 

 

Реферат:

«Методы расщепления белков и пептидов»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнила студентка 2 курса

72202 группы

Титова Ульяна Михайловна

Преподаватель: Соболев Павел  Сергеевич

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Петрозаводск 

2013

 

Оглавление:

  1. Введение
  2. Методы разделения белков и пептидов.
    1. Диализ.
    2. Гель-хроматография.
    3. Афинная хроматография.
    4. Ионообменная хроматография.
    5. Адсорбционная хроматография.
    6. Распределительная хроматография.
    7. Ультрацентрифугирование.
    8. Электрофорез.
    9. Изоэлетрофокусирование.
  3. Заключение.
  4. Список использованной литературы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение:

Пептиды – это семейство  веществ, молекулы которых построены из остатков α-аминокислот, соединённых в цепь пептидными (амидными) связями —CO-NH—. Природные полипептиды, состоящие из сотен аминокислот, с молекулярной массой более 6000 дальтон называют белками.

Препараты высокоочищенных белков находят разнообразное применение в научных исследованиях, медицине и биотехнологии. Так как многие белки, и в особенности глобулярные, высоколабильны (подвижны), выделение проводят с помощью предельно мягких методов и при пониженной температуре (0-5°С). Критерием чистоты белков является его гомогенность при электрофорезе, хроматографии и центрифугирование.

В данный момент белки и  пептиды из смеси можно выделить несколькими способами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выделение белка из смеси  в чистом виде:

  1. Диализ.

Для отделения низкомолекулярных  примесей или замены состава среды  используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. При диализе

низкомолекулярные вещества удаляются из образца и замещаются буфером. Традиционным является способ диализа через целлофановую пленку. В продаже

имеются диализные трубки различного диаметра, обычно они не пропускают молекулы

крупнее 15 000-20 000 Да (дальтон). Для более полного удаления низкомолекулярных веществ в процессе диализа необходима смена буферного раствора в диализате. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе. Диализ является длительной процедурой, ставят его обычно на ночь. Удаление солей и замену буфера предпочтительней проводить более быстрым методом гельфильтрации. Для этих целей наиболее широко применяется сефадекс G-25. Объем образца не должен превышать 1/5 объема колонки, скорость элюции - не более 50 мл/ч на 1 см3

поперечного сечения. Удобно в лаборатории иметь ряд заранее подготовленных колонок для быстрого обессоливания.

  1. Гель-хроматография.

Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов. Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью. Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций . Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы . Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии.

  1. Афинная хроматография.

Основана  на принципе избирательного взаимодействия белков с закрепленными на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием (вымывание) буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты.

  1. Ионообменная хроматография.

Для проведения ионообменной хроматографии используют ионообменники. Это нерастворимые в воде гранулы, на поверхности которых имеются  электрические заряды. В качестве примера можно привести карбоксиметилцеллюлозу. Для ее получения гранулы обычной целлюлозы размером 40–80 микрон обрабатывают таким образом, что часть гидроксильных групп превращается в карбоксильные. В водной среде они диссоциируют, отдавая ион H+: R–COOH ↔ R–COO– + H+

Допустим, у нас имеется  смесь трех белков с изоэлектрическими  точками 5,5; 6,5 и 7,5. При рН 5 все они будут иметь положительный заряд и связываться с ионообменником за счет электростатических сил. Если повысить рН до 5,5, то первый белок достигнет изоэлектрической точки, перестанет связываться с карбоксиметилцеллюлозой, и его можно будет отделить от остальных белков. Если после этого поднять рН до 6,5, то с ионообменника будет удален второй белок, а третий можно удалить, повысив рН до 7,5.

Снимать белки с ионообменника  можно изменением не только рН, но и  концентрации ионов в растворе. При рН 5 у первого белка будет наименьший заряд, и он связывается с карбоксиметилцеллюлозой слабее других. Если добавить к ионообменнику раствор KCl невысокой концентрации, то ионы Kбудут вытеснять первый белок, а второй и третий при этом еще будут связаны с ионообменником. При дальнейшем повышении концентрации KCl можно удалить второй белок, а затем и третий. Для проведения хроматографии используют также и анионообменники.

Практически ионообменную хроматографию  проводят следующим образом. Суспензию  гранул ионообменника наливают в  специальный цилиндрический сосуд  – колонку. На дне колонки есть отверстие, а над ним расположена  мелкопористая сетка, через которую  не проходят гранулы, но свободно протекают  растворы. Суспензии дают осесть и  промывают, пропуская через колонку  соответствующий раствор. Затем  наносят смесь разделяемых веществ (например, белков) и проводят отмывку  от несвязавшихся с ионообменником. Наконец, последовательно пропуская растворы с различной ионной силой и разным рН, снимают с колонки нужные белки.

Ионообменная хроматография  позволяет разделять вещества по электрическому заряду.

  1. Адсорбционная хроматография.

Разделение компонентов  смеси (образца) основано на их различной  сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в колонку и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку – компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты.

Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

  1. Распределительная хроматография.

Основана на распределении веществ, находящихся в смеси, между двумя жидкими фазами: подвижной и неподвижной, которые не смешиваются. Твердая фаза служит матрицей для стационарной фазы. Это может быть фильтровальная бумага, специальная хроматографическая бумага, тонкий слой сорбента на носителе. Вода удерживается порами носителя и фиксируется, а подвижная фаза – органический растворитель – продолжает двигаться, увлекая за собой растворенный в ней компонент смеси. Различные вещества многократно перераспределяются между неподвижной (вода) и подвижной (органический растворитель) фазами по длине носителя с различной скоростью в соответствие с коэффициентом их растворимости. Коэффициент растворимости (распределения) – важная величина, характеризующая физические свойства различных веществ. Есть соединения, которые обладают хорошей растворимостью в неорганических растворителях, поэтому они будут передвигаться по носителю с подвижной фазой. Другие вещества лучше растворяются в воде, вместе с которой задерживаются в порах носителя, поэтому движутся медленнее. Таким образом, происходит разделение веществ, находящихся в смеси. В процессе хроматографирования происходит распределение каждого вещества между подвижной и неподвижной фазами до тех про, пока не будет достигнуто состояние равновесия, константа которого зависит от выбранных растворителей и природы разделяемого вещества.

  1. Ультрацентрифугирование

Выполняется на высокоскоростных (24 000оборотов в мин и выше) ультрацентрифугах. Предназначенные именно для разделения белков называются "ультрацентрифугами Сведберга". Под воздействием центробежных сил происходит движение белковой молекулы в направлении от оси вращения. Чтобы вызвать "седиментацию" относительно мелких белковых молекул, требуется создать довольно значительное цетробежное поле, т.е. скорость вращения ротора центрифуги должна быть достаточно высока. Белки различной массы продвигаются с различными скоростями, наиболее тяжелые движутся быстрее, малые - медленнее. Наблюдать за движением полос белка в процессе центрифугирования позволяет специальная оптическая система (УФ 260 или 280 нм) по поглощению в ультрафиолетовом спектре.

  1. Электрофорез.

Электрофорез белков — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли. Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов).

Физический принцип метода электрофореза заключается в следующем. Молекула белка в растворе при любом рН, отличающемся от её изоэлектрической точки, имеет некий средний заряд. Это приводит к тому, что белок движется в электрическом поле. Движущая сила определяется величиной напряженности электрического поля Е умноженной на суммарный заряд частицы z. Этой силе противостоят силы вязкости среды, пропорциональные коэффициенту вязкости η, радиусу частицы r (стоксовскому радиусу) и скорости ν.

Е·z = 6πηrν

Электрофорез является единственным надежным способом обнаружения парапротеинов в биологических жидкостях, а также является первичной процедурой отбора. Это информативный клинический метод для обнаружения изменений сывороточных белков, связанных с определенными заболеваниями. Изменения по сравнению с нормальной структурой белка сыворотки, (наличие дополнительных компонентов (моноклональные полос), увеличение / уменьшение нормального содержания компонентов, предупреждает врача о необходимости проведения дополнительного анализа белков. Электрофорез белков помогает выявить заболевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразования (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетические поломки и др. Известен ряд своеобразных электрофоретических "синдромов" – типичных картин электрофореграмм, характерных для некоторых патологических состояний.

Электрофорез редко включают в схемы очистки.

Во-первых, из-за дороговизны  аппаратуры, во-вторых, электрофоретическое  разделение

зависит от разницы в величине зарядов разделяемых белков, как  и в случае

ионообменной хроматографии  эффективного и не столь дорогого метода.

  1. Изоэлетрофокусирование.

Принцип метода заключается  в том, что если на колонку, вдоль  длины которой сформирован градиент рН, нанести образец, а потом подключить концы колонки к источнику тока, то молекулы белка будут двигаться по колонке до тех пор, пока не достигнут той области, где величина рН окажется равной  величине изоэлектрической точки белка. Для создания градиента рН используются сложные смеси амфотерных соединений – амфолиты.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение:

Мы рассмотрели несколько  видов разделения белков и пептидов из смеси, но с каждым годом появляются все новые и новые способы. Методы разделения также являются методами, подтверждающими гомогенность того или иного белка. С помощью некоторых способов можно определить наличие патологий в жидкостях организма. В общем, методики очистки белков и пептидов являются универсальными помощниками в современной клинической диагностике.

Информация о работе Методы расщепления белков и пептидов