Методы определения цитокинов

Белгородский государственный национальный исследовательский университет.

  Белгородская областная клиническая больница    Святителя Иоасафа.         

 

 

 

 

 

 

 

 

                         Реферат по теме:

                        «Методы  определения цитокинов»

                           

 

      

                       

 

 

 

 

 

 

 

                                                                 Белгород 2014 г

                       Методы  определения цитокинов.

         Цитокины — эндогенные полипептидные и белковые медиаторы межклеточного взаимодействия, регулирующие эмбриональное
развитие, некоторые нормальные физиологические функции организма, защитные реакции при внедрении патогенов и при развитии
опухолей, формирование аллергических, аутоиммунных и иных
иммунопатологических процессов и восстановление поврежденных
тканей при травмах. Именно поэтому совершенно очевидно, что
цитокиновая регуляция имеет огромное значение и в норме, и при
патологии. Известно более 200 индивидуальных веществ, принадлежащих к семейству цитокинов: интерфероны, интерлейкины с
исторически сложившимися порядковыми номерами, ростовые и
колониестимулирующие факторы, хемокины, медиаторы из группы
фактора некроза опухолей, трансформирующие ростовые факторы
и некоторые другие молекулы.

        Современное учение о цитокинах имеет четыре независимых
источника. Первый и наиболее важный источник - учение о лимфокинах.
Это направление активно развивалось в середине 1960-х гг., когда
было показано, что белки, продуцируемые лимфоцитами, регулируют рост и функцию различных лейкоцитов. Начало учению о
лимфокинах было положено исследованиями, демонстрирующими
способность супернатантов, полученных от сенсибилизированных
лимфоцитов после их стимуляции специфическим антигеном, угнетать миграцию нормальных макрофагов. Фактор, ответственный за
это, был назван фактором угнетения миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor). В дальнейшем был введен термин
«лимфокин», означающий растворимые клеточные факторы, которые продуцируются сенсибилизированными лимфоцитами во время
их взаимодействия со специфическим антигеном и ответственны за
развитие клеточно-опосредованных иммунологических реакций.
Примером классического лимфокина может быть интерлейкин-2
(IL-2), играющий центральную роль в регуляции роста и функции
Т-клеток. Затем показано, что лимфоциты могут продуцировать один или несколько митогенных факторов для других лимфоцитов. Так, митоген-активированные мононуклеары человека продуцируют фактор, поддерживающий рост
Т-лимфоцитов. Этот фактор в настоящее время известен как IL-2. Однако
вскоре выяснилось, что моноциты также являются источником белков (монокинов), которые могут модулировать функции лейкоцитов. Первый цитокин
моноцитарно-макрофагального происхождения — фактор некроза опухоли (tumor
necrosis factor - TNF). Кроме прямого цитотоксического эффекта по отношению к
некоторым опухолевым клеткам in vitro, TNF обладает множеством других биологических эффектов в отношении различных лейкоцитов и тканевых клеток. Среди
первых цитокинов моноцитарного происхождения был описан фактор активации лимфоцитов (lymphocyte activating factor), известный в настоящее время как
интерлейкин-1 (IL-1). Другие исследователи описали этот же фактор под такими
названиями, как митогенный белок, лейкоцитарный пироген, эндогенный пироген, фактор, активирующий B-клетки, эндогенный медиатор лейкоцитов и др.

Второй источник — учение об интерферонах. Интерферон впервые был описан
как фактор, который продуцируется вирусиндуцированными клетками, способными вызывать клеточную резистентность к вирусным инфекциям. Затем был
открыт вирус-ингибирующий белок (interferon gamma — IFNg), продуцируемый
митоген-активированными Т-лимфоцитами. IFNg, продуцируемый Т-клетками
и естественными киллерами, по структуре полностью отличается от большого
семейства IFNa/β, продуцируемого множеством различных клеток: моноцитами,
естественными киллерами, В-лимфоцитами, различными негемопоэтическими
клетками. Интерфероны были определены как факторы роста и дифференцировки
клеток иммунной системы и клеток других систем организма человека. В результате граница между лимфокинами/монокинами и интерферонами стала размытой,
сегодня понятно, что интерфероны — это цитокины.

Третьим источником являются факторы роста гемопоэтических клеток (колониестимулирующие факторы; colony-stimulationg factors — CSF). Их основной функцией является обеспечение пролиферации и дифференцировки гемопоэтических
клеток, а название отражает способность формировать гранулоцитарные или
моноцитарные колонии. Эти факторы также регулируют некоторые функции зрелых клеток, что размывает границы между ними и лимфокинами/монокинами.

Наконец, четвертым источником являются факторы роста негемопоэтических
клеток: фактор роста, продуцируемый тромбоцитами (platelet-derived growth factor — PDGF), эпидермальный (epidermal growth factor — EGF) и фибробластный
(fibbroblast growth factor — FGF) факторы роста, трансформирующий фактор роста
(transforming growth factor β — TGFβ). Как упоминалось выше, лимфокинами называют продукты сенсибилизированных лимфоцитов при воздействии на них специфического антигена. Однако
в связи с тем, что со временем способность продуцировать аналогичные факторы
была обнаружена и у других типов клеток, термин «лимфокины» было предложено заменить на «цитокины». Кроме того, в 1979 г. на Втором международном совещании по лимфокинам был утвержден термин «интерлейкины» для растворимых
белков, обеспечивающих взаимодействие между различными популяциями лейкоцитов. В качестве первого шага на Совещании были приняты IL-1 и IL-2, которые
ранее имели множество различных названий. Несмотря на то, что множество
цитокинов относятся к семейству интерлейкинов, часть факторов сохраняют свои
старые названия, отражающие лишь одну из функций этих плейотропных агентов:
CSF, IFN, TNF и т,д. Таким образом, цитокины — регуляторные белки, секретируемые лейкоцитами крови и другими клетками организма человека, плейотропные
эффекты которых включают регуляцию клеток иммунной системы и модуляцию
воспалительной реакции.

      Цитокины имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик, отличающих их от других классов регуляторных молекул, среди которых
важнейшими считаются следующие: характерные биохимические свойства (цитокины представляют собой белки или полипептиды с молекулярной массой от 5 до
50 кДа), проявление биологической активности в пикограммовых концентрациях,
отсутствие тканевой и антигенной специфичности, плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, проведение сигнала путем взаимодействия со
специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети. В
связи с этим цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему
регуляции, существующую наряду с нервной и эндокринной системами поддержания гомеостаза, причем все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы.

Характерные признаки цитокинов:

• В основном цитокины — простые белки или гликопротеины с молекулярной
массой до 30 кДА; лишь некоторые цитокины являются олигомерами с высокой молекулярной массой.

• Продукция цитокинов регулируется различными индукторами на уровне
транскрипции или трансляции.

• Продукция цитокинов кратковременна, а радиус действия обычно короткий
(типичное действие аутокринное или паракринное, но не эндокринное).

• Цитокины реализуют свои эффекты через специфические высокоаффинные
рецепторы с Кd=109-1012 м.

• Фенотипически действие цитокинов приводит к повышению (или к снижению) скорости клеточной пролиферации, к изменению клеточной дифференцировки и проявлению различных функций соматических клеток.

• Хотя набор биологических эффектов различных цитокинов может различаться, мишенями для большинства цитокинов являются гемопоэтические
клетки.

В табл. 19-1 представлены отличительные признаки гормонов и цитокинов.

 Как следует из вышесказанного, цитокины и гормоны имеют много общего,
однако между ними есть существенные отличия. Классические гормоны продуцируются специализированными клетками: например, инсулин продуцируется
β-клетками поджелудочной железы, гормон роста — гипофизом, паратгормон —
паращитовидными железами и т.д. Цитокины, наоборот, выделяются менее специализированными клетками. Кроме того, различные типы клеток могут синтезировать один и тот же цитокин. Например, IL-1 продуцируют моноциты, макрофаги,
мезангиальные клетки, естественные киллеры (NK-клетки), Т- и В-лимфоциты,
нейтрофилы, эндотелиальные клетки, мышечные клетки, фибробласты, астроциты, клетки микроглии. Однако существуют исключения: IL-2, IL-5 и лимфотоксин
продуцируются исключительно Т-лимфоцитами. Одно из основных отличий цитокинов от гормонов — это наличие у цитокинов, имеющих структурное сходство,
принципиально различных биологических эффектов (например, TNF-α и TNF-β; ). Кроме того, один и тот же цитокин проявляет многообразные биологические эффекты по отношению к различным клеткам-мишеням (табл. 19-2).

Несмотря на некоторые различия, цитокины, факторы роста и гормоны формируют большое семейство внеклеточных сигнальных молекул со сходным механизмом действия. Так, рецепторы для некоторых цитокинов и гормонов (IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF),
эритропоэтин, пролактин, гормон роста) имеют сходную структуру. Также структурная гомология была описана для рецепторов к PDGF и макрофагальному колониестимулирующему фактору (M-CSF). Более того, сходные механизмы обеспечивают передачу сигнала от рецепторов (к гормонам, факторам роста, цитокинам) к
клеточному ядру и приводят к сходным биологическим эффектам.

      Роль цитокинов в регуляции функций организма может быть разделена на
4 основные составляющие:

• регуляция эмбриогенеза, закладки и развития органов, в том числе органов
иммунной системы;

• регуляция отдельных нормальных физиологических функций;

• регуляция защитных реакций организма на местном и системном уровне;

• регуляция процессов регенерации тканей.

       Экспрессия генов отдельных цитокинов происходит стадиоспецифически на
определенных этапах эмбрионального развития. Факторы стволовых клеток,
трансформирующие ростовые факторы, цитокины семейства TNF и хемокины
регулируют дифференцировку и миграцию различных клеток и закладку органов
иммунной системы. После этого синтез некоторых цитокинов может не возобновляться, тогда как другие продолжают регулировать нормальные физиологические
процессы или участвуют в развитии защитных реакций. Несмотря на то, что большинство цитокинов являются типичными индуцибельными медиаторами и в постнатальном периоде не синтезируются клетками
вне воспалительной реакции и иммунного ответа, некоторые из этих веществ не
подпадают под это правило. В результате конститутивной экспрессии генов часть
из них синтезируется постоянно и в достаточно больших количествах находится
в циркуляции, регулируя пролиферацию и дифференцировку отдельных типов
клеток в течение всей жизни, примером такого типа физиологической регуляции
функций цитокинами может быть постоянно высокий уровень эритропоэтина и
некоторых CSF для обеспечения гемопоэза. Цитокины, в первую очередь, регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев. На тканевом уровне цитокины ответственны за
развитие воспаления, а затем регенерации тканей. При развитии системной
воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции
гомеостаза. Попадание цитокинов в циркуляцию, безусловно, означает, что местная защита не справилась с патогеном, требуется включение системной воспалительной реакции для предотвращения его распространения и развития сепсиса.
Регуляция защитных реакций организма цитокинами происходит не только в
рамках иммунной системы, но и на уровне целостного организма, где цитокины
осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной
и другими системами и служат для их вовлечения в организацию и регуляцию
единой защитной реакции. Цитокины играют ключевую роль в регуляции врожденного иммунитета. Не
менее важное значение цитокины имеют в формировании и развитии реакций
специфического иммунитета, прежде всего связанных с регуляцией пролиферации
и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов. Сейчас не вызывает сомнения разделение популяции Т-лимфоцитов на два принципиально разных класса: Т-хелперы
и цитотоксические Т-лимфоциты. Благодаря дальнейшим исследованиям функций активированных антигеном Т-лимфоцитов хелперов выяснилось, что эта
популяция клеток также неоднородна и может быть разделена на подклассы по
функциональной активности. Эта активность связана, главным образом, с синтезируемыми цитокинами. Оказалось, что Т-хелперы различаются между собой
именно набором продуцируемых цитокинов. Активация Тh1, секретирующих IL-2
и IFNg, ведет к стимуляции, главным образом, функций Т-лимфоцитов и макрофагов и к развитию клеточного типа ответа, тогда как синтез Th2 IL-4, IL-5, IL-10
и IL-13 стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета. Защита
организма от внутриклеточных патогенов происходит с помощью формирования
клеточного иммунитета, зависимого от Тh1, тогда как внеклеточные патогены
нейтрализуются и выводятся из организма благодаря гуморальному иммунитету,
поддерживаемому Th2. Направление антигензависимой дифференцировки Т-лимфоцита хелпера
зависит от присутствия в межклеточном пространстве цитокинов, синтезируемых, главным образом, антигенпредставляющими клетками и определяющими
путь дифференцировки активированных антигеном наивных Т-лимфоцитов в
разные типы Th клонов. У человека описаны, по крайней мере, 3 типа Th-клонов,
из них клоны Thl и Th2 почти полностью соответствуют аналогичным клонам
Т-лимфоцитов мышей. Дифференцировка Тh1 индуцируется IL-12, который синтезируется макрофагами и дендритными клетками после взаимодействия молекулярных структур патогенов с толл-подобными рецепторами (toll-like receptors)
данных клеток. IL-12 взаимодействует со своими специфическими рецепторами
на ThO и запускает активацию сигнального пути с участием транскрипционного
фактора T-bet, являющегося основной внутриклеточной молекулой для дифференцировки Thl. Th2 дифференцируются, главным образом, под действием IL-4, который может
синтезироваться базофилами и тучными клетками в ответ на проникновение в
ткани аллергенов, а также под действием цитокина ТСЛП (тимический стромальный лимфопоэтин), синтезируемого эпителиальными клетками в коже и легких и
активирующего функции миелоидных дендритных клеток (ДК), в свою очередь
активирующих Th2. Интересно, что сам IL-4, синтезируемый Th2. является основным фактором в определении дифференцировки стимулированных антигеном
наивных CD4+ (CD — cluster of differentiation) Т-клеток в Th2. Изучение активации Т-лимфоцитов хелперов человека привело к появлению
более сложной схемы развития Th-клонов. Выяснилось, что IL-23, еще один цитокин семейства IL-12, ответственен за дифференцировку особого типа Th-клонов,
продуцирующих IL-17 и получивших название Thl7. Вместе с IL-23 в дифференцировке Тh17 принимают участие IL-6, IL-1α и IL-1β. Цитокины семейства IL-17
стимулируют синтез ряда провоспалительных цитокинов макрофагами и за счет
этого усиливают воспалительную реакцию, изначально вызванную патогеном.

В последнее время описаны также клоны Th человека, дифференцирующиеся под
действием третьего члена семейства IL-12 — IL-27 и синтезирующие преимущественно IL-10. Значение дифференцировки этих клонов при встрече с антигеном
может заключаться в негативной регуляции активации клонов Thl, Th2 и Thl7 и в
подавлении воспалительной реакции любого типа. Кроме того, существуют клоны
Th, относящиеся к естественно встречающимся регуляторным Т-лимфоцитам, экспрессирующим поверхностные маркеры CD4, CD25 и транскрипционный фактор
FохРЗ. Дифференцировка этого типа Th, по-видимому, происходит в тимусе под
влиянием тимического стромального лимфопоэтина, секретируемого клетками
эпителия медуллярной зоны тимуса, а также IL-2, синтезируемого как в тимусе, так
и на периферии, хотя окончательная ясность в схеме дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов отсутствует.

          Методы оценки функционирования  системы цитокинов. Изучение системы цитокинов как in vivo, так и in vitro проводится в зависимости
от конкретных задач, стоящих перед лабораторией, и включает следующие основные подходы.

• Генетический анализ на предмет отсутствия мутаций в генах цитокинов, их
рецепторов и белков внутриклеточных сигнальных систем запуска синтеза и
передачи сигнала.

• Анализ полиморфизма генов цитокинов.

• Изучение экспрессии генов цитокинов.

• Изучение уровня продукции цитокинов клетками в культуре.

• Определение концентраций цитокинов в биологических жидкостях.

• Изучение синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток.

• Изучение синтеза цитокинов в тканях.

Все перечисленные методы могут быть разделены на три основные группы,
появившиеся в следующем порядке по мере развития исследований системы цитокинов и развития методологических подходов в целом:

1) методы оценки биологической активности цитокинов;

2) иммунохимические методы;

3) молекулярно-биологические методы.

                                         Биологические методы.

       Первые эксперименты, приведшие к открытию и начальной характеристике
цитокинов, были связаны с изучением их биологической активности. Так, на
основании изучения противовирусной активности в культурах зараженных вирусами фибробластов, был открыт интерферон. Несомненно, биологические методы измерения уровня цитокинов являются очень ценными для исследователей.
Эти методы отличаются достаточно высокой чувствительностью и, с биологической точки зрения, являются более правильными, поскольку измеряют только
биологически активные формы цитокинов, а следовательно, наиболее адекватно
отражают работу системы цитокинов in vivo. В связи с этим уже в первые годы
изучения цитокинов были разработаны несколько тестов с использованием
первичных культур клеток для оценки разнообразных биологических функций.
Однако определение биологической активности цитокинов с использованием
первичных культур клеток не соответствовало одному из главных требований —
стандартизации методик анализа. Именно поэтому вскоре для биологического
тестирования многих цитокинов были получены длительно культивируемые трансформированные линии клеток, отвечавших на действие цитокинов изменением пролиферации, дифференцировки или функциональной активности. Тем не менее во всех случаях стандартизация обеспечивается
сравнением биологического действия изучаемого цитокина с международными
стандартными образцами, выпускаемыми Международной лабораторией биологических стандартов ВОЗ в Национальном институте биологической стандартизации и контроля (Великобритания), которая выпускает и рассылает по запросу
охарактеризованные по биологической активности стандартные образцы цитокинов человека.